Biotechnology

بيوتكنولوژي

ژنتیک در گیاهان

چکیده
انتقال ژن یا جذب DNA فرایندی است که قطعه مشخصی از DNA ( معمولاً یک ژن خارجی وارد شده در پلاسمید باکتریایی) را به درون سلول¬ها وارد می¬نماید. در اصلاح نباتات، تکنیک¬های مرتبط با انتقال ژن از طریق تکثیر جنسی و رویشی به خوبی رایج می¬باشند. هدف از این تکنیک ها ایجاد تنوع ژنتیکی در جوامع گیاهی، انتخاب گیاهان برتر از نظر ژنهای کنترل کننده صفات مطلوب و همچنین حفظ تنوع واریته¬های گیاهی می باشد. با استفاده از تکنیک¬های اصلاحی مرسوم، پیشرفت های چشم¬گیری در زمینه بهبود عملکرد گیاهان زراعی حاصل شده است. معذالک این تکنیک ها وقت گیر هستند. در سالهای اخیر، بیوتکنولوژی گیاهی منبعی سرشار از ابداع و خلاقیت بوده است و برای رفع مشکلات قدیمی راه حل های نوینی فراهم کرده است. بنابراین، در این مقاله سعی شده است که چشم انداز حال و آینده انتقال ژن را در بهبود گیاهان زراعی مورد بررسی قرار دهد.
قدمه
دهها سال است که انتقال ژن بین گونه¬های گیاهی نقش مهمی در بهبود گیاهان زراعی بازی کرده است. بهبود گیاه چه در نتیجه انتخاب طبیعی و یا با تلاش¬های به¬نژادگران، همیشه بر اساس ظهور، ارزشیابی و گزینش ترکیبات صحیح آلل¬ها بوده است. صفات مفید از قبیل مقاومت به بیماری¬ها، حشرات و آفات از گیاهان غیر زراعی به واریته¬های گیاهان زراعی منتقل شده است. از سال 1970، پیشرفت قابل ملاحظه¬ای در ابداع ابزارهای لازم برای دستورزی اطلاعات ژنتیکی در گیاهان توسط روش¬های DNA نوترکیب رخ داده است. فرایند کلی ترانسفورماسیون ژنتیکی شامل معرفی، تلفیق و بیان ژن یا ژن¬های خارجی در گیاه پذیرنده است. گیاهانی که ژن¬های خارجی از منابع ژنتیکی دیگر را با خود حمل می¬کنند و آنها را به صورت پایدار در خود جای داده و بیان می¬نمایند، گیاهان تراریخت نامیده می¬شوند. تولید گیاهان تراریخت نتیجه کاربرد تلفیقی تکنولوژی rDNA، روش¬های انتقال ژن و تکنیک¬های کشت بافت می¬باشد. با استفاده از این تکنیک¬ها تولید گیاهان تراریخت در محصولات غذایی- لیفی، سبزیجات و درختان میوه و جنگلی میسر شده است. در سالهای اخیر، بیوتکنولوژی گیاهی منبعی سرشار از ابداع و خلاقیت بوده است و برای مشکلات قدیمی راه حل¬های نوینی فراهم کرده است. ژن¬های گیاهی کلون می¬شوند، علائم تنظیم کننده ژنتیکی رمز گشای می¬شوند و ژن¬ها از موجودات کاملاً غیر خویشاوند ( خصوصا باکتریها و ویروسها) برای اعطاء صفات زراعی مفید جدید، به گیاهان زراعی منتقل می¬شوند. ترانسفورماسیون ژنتیکی انتقال ژن¬های مطلوب ویژه را، بدون همراهی با هیچ ژن نامطلوبی از گونه¬های بخشنده به گیاه زراعی میسر ساخته است. در حالیکه در روش¬های اصلاحی مرسوم ژن¬های نامطلوب نیز همراه ژن¬های مطلوب منتقل می¬شوند. پتانسیل وارد کردن و بیان ژنهای خارجی گوناگون اولین بار در گیاه توتون توسط اگروباکتریوم (De Block et al. 1984) و روش بدون استفاده از ناقل (Paszhowski et al. 1984) توصیف شده است. لیست گونه¬های گیاهی که می¬توانند توسط ناقل آگروباکتریوم و روش بدون ناقل تراریخت شوند، به طور مداوم در حال رشد بوده و در حال حاضر توانایی تراریختی به بیش از 120 گونه گیاهی و در حداقل 35 خانواده گسترش پیدا کرده است. موفقیت¬ها اغلب شامل محصولات مهم اقتصادی سبزیجات، گیاهان زینتی، دارویی، درختان و گیاهان مرتعی می¬باشد. انتقال ژن و باززایی گیاهان تراریخت، دیگر جزو فاکتورهای محدود کننده در بهبود و کاربرد سیستم¬های ترانسفورماسیون عملی برای بسیاری از گونه¬های گیاهی نیستند. برای این گفته، کافی است اشاره شود که قبلاً گونه¬های تک لپه¬ای در خارج از حوزه میزبانیA. tumefacims قرار می¬گرفتند و این امر منجر به ابداع انتقال مستقیم DNA یا روش بدون ناقل برای ترانسفورماسیون گردید. معذالک اخیراً ترانسفورماسیون توسط آگروباکتریوم در گونه¬های تک لپه¬ای از قبیل گیاهان غذایی مهم از جمله برنج (Hiei et al. 1994)، ذرت (Ishida et al. 1996) و گندم (Cheng et al. 1997) گزارش شده است.
اولین نسل کاربرد مهندسی ژنتیک در محصولات کشاورزی به سمت تولید گیاهان تراریخت بیان کننده ژن خارجی برای مقاومت به ویروس¬ها، حشرات، علفکش¬ها یا عوامل فساد بعد از برداشت و تجمع فراورده¬های ذخیره¬ای تغییرشکل یافته مفید بوده است. این موضوعات تحت عناوین ذیل بحث شده¬اند.

مقاومت به تنشهای زنده
ترانسفورماسیون ژنتیکی امکان ترانسفورم کردن گیاهان برای بهبود مقاومت به حشرات و پاتوژنها را میسر ساخته است و به سرعت به سمت تجاری شدن پیش می¬رود. این پیشرفت¬ها اساس راهکار اقتصاد پایدار و بدون استفاده از مواد شیمایی را برای کنترل آفات و بیماری¬ها تشکیل می¬دهد. مقاومت به تنش¬های زنده تحت عناوین زیر بحث شده¬اند.
1- مقاومت به حشرات
2- مقاومت به ویروسها
3- مقاومت به بیماریهای قارچی و باکتریایی

1- مقاومت به حشرات
پیشرفت در مهندسی گیاهان تراریخت برای مقاومت به حشره، از طریق استفاده از ژنهای پروتئین کنترل کننده Bacillus thuringiensis حاصل شده است. مقاومت به حشره ابتدا در توتون (Vaeck et al. 1987) و گوجه فرنگی (Fischhoff et al. 1987) گزارش شد. امروزه ترانسژن مقاوم به حشره از هر منبعی از جمله گیاهی، باکتریایی و یا منابع دیگر می¬تواند به منظور افزایش سطح مقاومت به حشره، به گیاهان منتقل شود. تقریباً 40 ژن متفاوت اهدا کننده مقاومت به حشره، به گیاهان زراعی وارد شده است. ژنهای اهدا کننده مقاومت گیاهان به حشره از میکروارگانیسمها بدست آمده است. ژن Bt از Bacillus thuringiensis، ژن ipt ایزوپنتیل ترانسفراز از Agrobacterium tumefacines، ژن کلسترول اکسیداز از قارچهای استرپتومایسز و ژن pht از Photorhabdus luminescens. ژنهای مقاوم از گیاهان عالی می¬تواند به دو گرو تقسیم شود (1) بازدارنده¬های پروتئیناز و آمیلاز و (2) لکتین¬ها، لکتین گل حسرت (GNA)، لکتین نخود، لکتین برنج و غیره. ژن¬های مقاوم با منشاء حیوانی بازدارنده¬های پروتئیناز سرین از پستانداران و کرم شاخدار توتون (Manduca sexta) می¬باشد.

1-1- ژنهای مقاوم از میکروارگانیسمها
ژن توکسین Bt : Bacillus thuringiensis (Bt) باکتری حشره¬کشی است که یک ضد پرتئین تولید می¬کند. ژن¬های Bt، توکسین Bt را کد می¬کنند، که دارای طیف وسیعی از فعالیت حشره¬کشی می¬باشند. اکثر توکسین¬های Bt بر علیه لاروهای بال پولک داران فعال هستند، اما بعضی ها ویژه حشرات راسته دو بالان و قاب بالان هستند. عامل سمیت حشره¬های Bt یک پروتئین بزرگ می¬باشد. توکسین¬ها به صورت پروتئین¬های کریستالی سیکما توکسین (δ-endotoxins) در درون باکتری در خلال اسپورزایی تجمع می¬یابند. این پروتئین¬ها بعد از آلوده کردن حشره حساس، به فرم فعال در می¬آیند و در نتیجه با اختلال در انتقال یون باعث مرگ حشره می¬شوند. چندین ژن که توکسین¬های مؤثر بر بال پولک داران را تولید می¬نمایند، جداسازی شده¬اند. یکی از این ژن¬ها که متعلق به B. thuringinesis زیر گونه Kurstaki HD-1 می¬باشد. ژن¬های شیمری B. thuringinesis kurstaki دارای پروموتور s35 ویروس CaMV و یک توالی کد کننده برای یک پروتئین تغییر یافته کوتاهتر و فعال همانند ژن کامل، سنتز شده و در گیاهان گوجه فرنگی بیان شده¬اند (Fischhoff et al. 1987) مقدار پرتئین حشره¬کش در این گیاهان برای کشتن لاروهای Manduca sexta، Heliothis virescens، Heliothis zea کافی بود. بررسی نتاج گیاهان تراریخت نشان داد که ژن B. thuringinesis kurstaki به صورت یک ژن غالب مندلی تفکیک می¬یابد. ژن سمی دیگر از B. Thuringinesis، نژاد Berlkiner 1715 ،کلون شده است. این ژن یک پرتئین Bt2، 1155 آمینو اسیدی را تولید می¬نماید. آنالیز سطح بیان یک ژن شیمری مبتنی بر Bt2 در گیاهان توتون نشان داد که کیفیت سم و فعالیت حشره¬کشی آن با هم ارتباط دارند (Veack et al. 1987). گیاهان توتون تراریخت در برابر تغذیه لاروهای Manduca sexta محافظت گردیدند. سم Bt برای حشرات مفید، پستانداران و انسان مضر نیست. این ژن به صورت یک ژن غالب منفرد تفرق می¬یابد.
نژادهای Bt دارای تنوع گسترده¬ای از ژن¬های کد کننده اندوتوکسین سیکما (δ-endotoxins) می¬باشند. گزارشات مربوط به کلون کردن و تعیین توالی اولین ژن کد کننده پرتئین حشره¬کش در سال 1981 منتشر گردید. تا کنون بیش از 100 توالی ژن پرتئین کریستالی انتشار یافته است. هریک از پروتئین¬های کریستالی طیف فعالیت خاصی دارد. بعنوان مثال، پروتئین Cry1Ab در برابر کرم ساقه خوار اروپایی ذرت شدیداً فعال است و در هیبریدهای ذرت Bt کنونی مورد استفاده قرار می¬گیرد. پرتئین Cry1Ab برای لاروهای کرم گیاهچه توتون و کرم غوزه پنبه شدیداً سمی است و در واریته¬های پنبه Bt بیان می¬شود و این گیاهان را در برابر سوسک کلورادوی سیب زمینی حفاظت می¬نماید.
سیکما- اندوکسین¬های Bt به هر دو صورت (اندازه کامل) و (کوتاه شده) به گیاهان انتقال داده شده¬اند و مقاومت تائید شدهای را در برابر توتون (M.sexta)، آفات گوجه فرنگی Heliothis ( virescens و Helicovera zea) و آفات سیب زمینی (Phthorimeae operculella) بوجود آورده¬اند. اولین گیاهانی که تولید شدند، قادر به سنتز پروتوکسین (Protoxin) کامل بودند، اما به دلیل بیان ضعیف ژن مقادیر کمی دلتا توکسین تولید می¬شد که حاصل آن عدم بروز مقاومت و یا مقاومت اندک بود. پیشرفتهای بیشتر، سرانجام منجر به مطلوب شدن بیان ژن cry در گیاهان شد. چند سالی است که اولین نسل گیاهان حشره¬کش برای مقاصد تجاری وارد بازار شده است.

1-2- ژن¬های مقاومت منشاء گرفته از میکروارگانیزم¬های دیگر
پروتئین کلسترول اکسیداز (Co) موجود در کشت فیلتر شده Sterptomyces بر لارو شپشک غوزه اثر سمیت حاد دارد. این ژن به گیاهان توتون منتقل گردیده است. ژن ایزوپنتیل ترانسفراز (ipt) Agrobacterium tumefaciens یک آنزیم کلیدی در مسیر بیوسنتز سیتوکینین کد می¬نماید. بیان ipt در توتون، گوجه فرنگی توسط یک پروموتور القاء شونده توسط زخم (wound inducible promoter) سبب کاهش تغذیه کرم شاخدار توتون (M. sexta) از برگ¬ها و کاهش بقای شته سبز هلو شده است.


1-3- ژن¬های مقاومت از گیاهان عالی
همچنانکه سموم Bt با موفقیت به درون گیاهان مهندسی می¬شوند، تلاش¬هایی نیز در جهت کشف ژنهای سموم حشره¬کش غیر Bt صورت می¬گیرد. تعدادی از پروتئین¬های حشره¬کش غیر Bt در احتیاجات غذایی حشرات مداخله می¬نمایند. دو گروه عمده از ژنهای با منشاء گیاهی وجود دارد که برای ایجاد مقاومت به حشرات در گیاهان زراعی از طریق به تاخیر انداختن رشد و نمو حشره مورد استفاده قرار می¬گیرند.

1-3-1- بازدارندههای پروتئیناز (Proteinase inhibitors)
از سال 1938 مشخص شده است که گیاهان دارای پپتیدهایی هستند که به عنوان بازدارنده¬های پروتئیناز عمل (PIPs) می¬نمایند. پروتئینازهای مختلف عبارتنداز پروتئینازهای سرین، سیستئین، آسپارتیک و متالو. پروتئینازها آزاد شدن اسیدهای آمینه از پروتئین جیره غذایی را کاتالیز می¬نمایند، و به صورت مواد مغذی ضروری برای رشد و نمو حشرات را تامین می¬نمایند. بازدارنده¬های پروتئیناز با مداخله در عمل آنزیمهای هضمی حشره، آن را از مواد مغذی ضروری محروم می¬سازند. به دو نمونه از ژن بازدارنده پروتئیناز در ذیل به آنها اشاره شده است:

الف) بازدارنده ترپسین لوبیا چشم بلبلی (CpTI) (Cowpea trypsin inhibitor gene)
CpTI که در لوبیا چشم بلبلی (Vigna unguiculata) یافت می¬شود، فعالترین بازدارنده¬ای است که تاکنون شناسایی شده است. این ژن بازدارنده مواد آنتی متابولیتی تولید می¬نماید که سبب محافظت در برابر سوسک ( Callosobruchus maculates)که یک آفت انباری اصلی است، می¬شود. علاوه بر این، این ژن همچنین برای حشرات متعددی از خانواده بال پولکداران (Heliothis virescens)، ( Manduca sexta) قاب بالان (Callosobruchus، Antonomous grandis) و راست بالان (Locusta migratoria) مضر است، اما برای پستانداران بیضر می¬باشد. ژن CpTI کلون شده و ساختارهای حاوی پروموتور S35 ویروس CaMV و یک کلون cDNA با طول کامل bp550 از آن برای تراریخت نمودن دیسکهای برگی توتون مورد استفاده قرار گرفت. آزمایش سنجی برای فعالیت حشره¬کشی گیاهان توتون تراریخت با کرم غوزه پنبه (Heliothis zea) انجام شد. بقاء حشره و میزان خسارت وارده به گیاه، در گیاهان تراریخت در مقایسه با گیاهان شاهد، بطور واضحی کاهش یافت.

ب) بازدارنده آلفا – آمیلاز (α-amylase inhibitor)
سه ژن بازدارنده آلفا- آمیلاز در توتون بیان شده¬اند، اما تاکید اصلی بر روی انتقال ژن بازدارنده آلفا – آمیلاز (AI-Pv) α جدا سازی شده از لوبیا ( Phaseolus vulgaris) بوده است. این ژن بر علیه Zabrotes subfaciatus و Callosobruchus chinesis عمل می¬نماید. این پروتئین بازدارنده آلفا- آمیلاز، تغذیه لاروی را در بخش میانی لوله گوارش را بلوکه می¬نماید. لوله گوارش لارو یک آنزیم آلفا-آمیلاز ترشح می¬کند که نشاسته را هضم می¬نماید. با اضافه کردن یک پروتئین، که آلفا- آمیلاز روده حشرات را متوقف نماید، شپشه دچار گرسنگی شده و می¬میرد.

1-3-2- لکتین¬ها (Lectins)
لکتین¬ها خانواده بزرگ دیگری از پروتئین¬ها هستند که می¬توانند بعنوان سموم ضد حشره برای مهندسی ژنتیک مقاومت به حشرات مورد استفاده قرار گیرد. لکتین¬ها گلیکوپروتئینهای گیاهی هستند. توجهات اخیر بطور عمده بر روی لکتین Galanthus nivalis که به GNA نیز معروف است، متمرکز شده است، زیرا که فعالیت ضد شته از خود نشان می¬دهد. ژن این پروتئین، با موفقیت در مطالعات مهندسی ژنتیک مورد استفاده قرار گرفته و در گونه¬های گیاهی مختلفی همچون سیب زمینی، و گوجه فرنگی بیان شده است. آزمونهای آزمایشگاهی با سیب زمینی تغییر یافته نشان داد که GNA، مرگ و میر را افزایش نمی¬دهد، اما سبب کاهش قابل ملاحظه¬ای در باروری می¬شود. یک ویژگی مهم این پرتئین این است که بر علیه حشرات مکننده و نفوذ کننده نیز عمل می¬نماید. با این وجود، یک عیب آن این است که این پرتئین زمانی خوب عمل می¬کند که به مقادیر فراوانی بلعیده شود، یعنی زمانیکه حشره در معرض مقادیر میکروگرمی این پروتئین در آزمایشات زیست سنجی در جیره غذایی قرار داده می¬شود. بنابراین، اگر چه که چند ژن کد کننده لکتین (آگلوتینین جنین گندم و لکتین برنج ) در گیاهان تراریخت بیان شده¬اند، ولی تاثیر حشره¬کشی آنها بسیار کمتر از آن است که مؤثر واقع شوند.

1-4- ژنهای مقاومت از حیوانات
ژنهای مقاومت مورد نظر ترجیحاً بازدارنده¬های پروتئیناز سرین از پستانداران و کرم شاخدار توتون Manduca sexta می¬باشد. بر اساس غربالگری در این¬ویترو بازدارندگی از پروتئولیز توسط عصاره¬های تعدادی از لاروهای بال پولک¬داران، بازدارنده ترپسین پانکراسی بواین (BPTI)، آلفا- آنتی ترپسین (α.AT) و بازدارنده اسپلین (SI)، بعنوان پروتئین¬های امید بخش مقاومت به حشرات شناسایی و به تعدادی از گیاهان منتقل گردیده¬اند. معذالک نتایج اولیه بر روی بید سیب زمینی در گیاهان سیب زمینی تراریخت، چندان رضایتبخش نیست. اما بازدارنده¬های پروتئیناز گرفته شده از Manduca sexta یعنی آنتی کیمیو ترپسین (Anti-chymiotrypsin) و آنتی الاستاز (Anti- elastase) بیان شده در پنبه و کتیناز (Chitinase) در توتون، تولید مثل را به ترتیتب در Bemisia tabaci و Heliothis virescens کاهش دادند، تعدادی از ژنهای عامل مقاومت به حشرات که برای تولید گیاهان تراریخت مورد استفاده قرار گرفته¬اند.

2- مقاومت به ویروس
به دلیل اندازه نسبتاً کوچک ژنوم ویروس¬های گیاهی، توسعه راهکارهای مولکولی برای کنترل بیماریهای ویروسی گیاهی به طور خاص موفق بوده است. راهکارهای مختلفی برای استفاده از تکنولوژی مولکولی به منظور تلفیق یا ایجاد فاکتورهای مقاومتی جدید در سیستمهای ویروسی گیاهان وجود دارد. روال کار به این نحو است که¬آن دسته از محصولات ژن یا ژنهای ویروسی شناسایی شوند که وقتی در زمان نامناسب یا با مقدار نادرست وجود دارند، با کارکردهای نرمال فرایند آلودگی مداخله نموده و مانع از پیشرفت بیماری شوند.

2-1- حفاظت متقاطع به واسطه پروتئین پوششی
مفهوم حفاظت متقاطع به توانایی یک ویروس برای جلوگیری یا بازدارندگی اثر رقابتی ویروس دیگر اطلاق می¬شود. اگر نژاد حساس از یک گیاه زراعی با نژاد ملایمی از یک ویروس تلقیح شود، نژاد حساس گیاه زراعی نسبت به نژادهای بیماریزاتر ویروس مقاوم می¬شود. برای اولین بار پاول آبل و همکاران (1986) نشان دادند که توتون تراریخت بیان کننده پروتئین پوششی ویروس موزائیک توتون (TMV) مقاومتی شبیه به مقاومتی که در حفاظت متقاطع به واسطه ویروس اتفاق می¬افتد، نشان می¬دهد. از آن زمان به بعد، تعدادی از ژنهای پوشش پروتئینی از گروههای ویروسی متفاوت پیدا شده¬اند که وقتی در گیاهان تراریخت بیان می¬شوند، مقاومت ایجاد می¬کنند. مقاومت به واسطه پروتئین پوششی در صورت کاهش تعداد مناطق آلودگی روی برگهای تلقیح شده عمل می¬کند، بیانگر این که یک مرحله اولیه در سیکل زندگی ویروس مختل شده است.
مطالعات نشان داده است که حفاظت متقاطع TMV ممکن است از پروتئین پوششی ویروس محافظت کننده ناشی شود که مانع از حذف پوشش از RNAهای ویروس رقیب می¬شود. اکثر سیستمهایی که در آنها مقاومت به واسطه پروتئین پوششی گزارش شده است، بر علیه ویروسهای RNAای پلاس- سنس با یک پروتئین کپسید بوده است. این راهکار در چند محصول زراعی از قبیل توتون، گوجه فرنگی، سیب زمینی، یونجه، هندوانه، کدو، برنج، ذرت و غیره استفاده شده است .
یک ویروس رشته منفی مهم، ویروس پژمردگی لکه¬ای گوجه فرنگی (Nucleocapsid protein) پیوند خورده است. این پرتئین در بسته¬بندی RNA ویروسی و همچنین در تنظیم مراحل رونویسی تا همانندسازی در طی سیکل آلودگی، فعالیت می¬نماید. با استفاده از این روش گیاهان تراریخت در توتون و گوجه فرنگی تولید شده¬اند.

2-2- مقاومت به واسطه پروتئین غیر ساختمانی (Non-structural protein mediated resistance)
ویروس¬ها، پروتئینهای غیر ساختمانی را کد می¬کنند که برای همانند سازی ضروری می¬باشند. اخیراً تعدادی از این پروتئینهای غیرساختمانی رپلیکاز (Replicase) کشف شده است که وقتی در گیاهان تراریخت بیان می¬شوند، درجات بالایی از مقاومت به آلودگی ویروس را ایجاد می¬نمایند. گلمبوسکی (Golemboski) و همکاران در سال 1990، برای اولین بار این پدیده را به بیان چهارچوب قرائت باز 54 کیلو دالتونی ویروس TMV در توتون تراریخت نشان دادند. توتون تراریخت مقاوم به قهوه¬ای شدن زودرس (PEBV) و سیب زمینی مقاوم به ویروس x (PVX) تولید شد.

2-3- مقاومت به واسطه سنس (sense) و آنتی سنس (Antisense)
استراتژی دیگر الگو گرفته از پاتوژن که برای کنترل ویروس¬های گیاهی مورد بررسی قرار گرفته است، بیان ترانسژن آنتی سنس و جدیداً قطعات سنس RNAهای ویروسی می¬باشد. اساس این راهکار، اتصال RNAی ویروسی با توالی های RNA مکملی است که توسط گیاه بیان می¬شوند. جفت شدن نامناسب RNA-RNA، از در دسترس بودن RNA ویروسی برای همانند سازی و بیان ژن، ممانعت می¬نماید. بنابراین ساختارهای آنتی سنس و سنس می¬توانند برای بلوکه کردن مراحل اولیه مهم که در ایجاد آلودگی ویروسی مهم هستند، مورد استفاده قرار گیرند. حفاظت آنتی سنس، در توتون که RNAی مکمل پروتئین پوششی ویروس را بیان می¬کند نشان داده شده است.

2-4- حفاظت با RNAی ماهواره¬ای (Satellite RNA protection)
RNAهای ماهواره¬ای، گروهی از RNAهای تک رشته¬ای کوچک (تقریباً 300 نوکلئوتید) هستند که برای همانندسازی و بسته¬بندی ویریونی به منظور ایجاد آلودگی در جای دیگر، به یک ویروس هم دست (Virus Helper) وابسته می¬باشند. بنابراین RNAی ماهواره¬ای برای تکثیر و انتقال به ویروس وابسته است، اگرچه وابسته به ژنوم ویروس نیست. این گونه RNA ماهواره¬ای با چندین ویروس دیگر مرتبط هستند. تعدادی از RNAی ماهواره¬ای تکثیر و علایم ویروس هم¬دست خود را تعدیل می¬نمایند. بسته به RNAی ماهواره¬ای مرتبط، طیف تغییر در ایجاد علایم از نکروز شدید تا کم اثر شدن کامل آن می¬باشد. بنابراین RNAهای ماهواره¬ای که علایم را تقلیل می¬دهند می¬توانند بطور بالقوه برای کاهش شدت بیماری ویروس یاریگر مورد استفاده قرار گیرند. بدین جهت، کاربرد آن در گیاهان تراریخت برای ایجاد مقاومت در گیاهان زراعی از جایگاه مهمی برخوردار گردیده است. تاین و همکاران (1987) و تاین و گوسوی (1991) نشان دادند که تلقیح عمدی یک نژاد ملایم ویروس موزائیک خیار (CMV) حاوی یک RNAی ماهواره¬ای تقلیل دهنده علائم، گیاهان توتون، فلفل، گوجه فرنگی و خیار را بطور موفقیت آمیزی در برابر یک نژاد بیماریزای CMV محافظت نمود و میزان خسارت را کاهش داد.
تاین و گوسوی (1991) گزارش کردند که 121 گیاه گوجه فرنگی تراریخت بیان کننده یک RNAی ماهواره¬ای تقلیل دهنده علائم CMV، در مقایسه با گیاهانی که یک نژاد قوی CMV به آنها تزریق شد، 50% عملکرد بیشتری تولید کردند. این راهکار مربوط به آن دسته از سیستم¬های ویروسی است که دارای RNAی ماهواره¬ای تقلیل دهنده هستند. کلن و همکاران (1997)، فلفل¬های قرمزی (Capsicum annum) تولید کردند که RNAی ماهواره¬ای CMV را بیان می¬نمودند. کاهش علائم آلودگی ویروسی در نتاج این گیاهان، پس از تلقیح با نژادهای CMV-Y یا CMV-Korea، تائید گردید.

3- مقاومت به بیماری
تا کنون تعداد زیادی از ژن¬های پاسخ دفاعی گیاهان که پروتئین¬های ضد میکروبی را کد می¬نمایند، کلون شده¬اند. اکثر این ژن¬ها در پاسخ به آلودگی و یا در مواجهه با ماکرومولکول¬های میکروبی در سطح نسخه¬برداری فعال می¬شوند. فراورده¬های ژن¬های پاسخ دفاعی می¬تواند شامل (1) آنزیم¬های هیدرولیتیک نظیر کتیناز، 1,3,β-D glucanase و دیگر پروتئین¬های مرتبط با بیماریزایی (PR) (pathogenesis related protein)، (2) پروتئین¬های غیرفعال کننده ریبوزوم (RIPs)، (3) پروتئین¬های ضد قارچ ( AFPs)، (4) آنزیم¬های بیوسنتزی برای تولید فیتوالکسین های ضد میکروبی، (5) فنولیکهای متصل به دیواره، اسموتین¬ها (osmotins)، تیونین¬ها(thionins) و (6) پراکسید هیدروژن، باشد.

3-1- پروتئینهای مرتبط با پاتوژن
این پروتئین¬ها دارای وزن مولکولی کم بوده و به مقادیر قابل توجهی در بافت¬های گیاهی آلوده تجمع می¬یابند. گروه¬های اصلی پروتئین¬های PR عبارتنداز PR-1، PR-2 ( 1و3- بتا گلوکاناز)، PR-3 (کیتینازها)، PR-4 (شبه Heveine) و PR-5 (اسموتین و شبه تائوماتین) در توتون. برای ایجاد مقاومت به پاتوژن¬ها در گیاهان زراعی از توانایی آنزیم¬های هیدرولیزکننده در شکستن کیتین و گلوکان دیواره سلولی قارچهای پاتوژن استفاده شده است.
ژن¬های کیتیناز متعددی از گیاهان جداسازی شده و توصیف گردیده¬اند. اولین گزارش در توتون بود که یک ژن کیتیناز باکتریایی بدست آمده از باکتری خاکزی Serratina marcescens، بطور پایدار تلفیق و در برگهای توتون بیان گردید (Jones et al. 1988). یک ژن کیتیناز اصلی از Phaseolus vulgaris تحت کنترل پروموتور ساختمانی قوی s35 ویروس CaMV، بطور ساختمانی و به مقدار زیاد در گیاهان تراریخت توتون و Brassica napus بیان شد (Broglie et al. 1991). این بیان، منجر به حفاظت قابل ملاحظه گیاهان از قارچ پاتوژن Rhizoctonia solani گردید که باعث مرگ گیاهچه پس از جوانه زنی می¬شود. در مورد B.napus، اگر چه حفاظت مدنظر به صورت تاخیری بود تا ممانعت کامل از بروز علائم، با این حال نتایج بدست آمده نشان داد که سطح حفاظت به اندازهای هست که از اهمیت افتصادی در شرایط مزرعه برخوردار باشد.
هیچ گزارشی در مورد افزایش مقاومت ناشی از بیان ژن 1-3-β-D-glucanase به تنهایی در گیاهان تراریخت وجود ندارد، اما ژن گلوکاناز وقتیکه با کیتیناز همراه می¬شود، مقاومت به قارچ را در توتون، گوجه فرنگی و هویج نشان می¬دهد.

3-2- پروتئین¬های ضد میکروبی (Anti-microbial proteins)
گیاهان و دیگر موجودات ممکن است دارای پروتئین¬های ضدمیکروبی باشند که ضرورتاً در ارتباط با پاسخ دفاعی القا شده نیستند، اما وجود این پروتئین¬ها سبب بروز مقاومت به پاتوژن¬ها می¬شود.این پروتئین¬ها شامل پروتئین¬های غیرفعال کننده ریبوزوم (RIPs)، پروتئین¬های غنی از سیستئین مانند لکتین¬ها، دفنسین¬ها، تیونین¬ها، لیزوزایم، بازدارنده¬های پلی گالاکتوروناز و غیره می¬باشد. گیاهان تراریخت مقاوم به پاتوژن¬ها در گونه¬های متعددی تولید شده¬اند.

3-3- فیتوالکسین¬ها
فیتوالکسن¬ها، متابولیت¬های ثانویه¬ای با وزن مولکولی کم و با فعالیت ضد میکروبی هستند که توسط گیاهان در پاسخ به یک آلودگی سنتز می¬شوند و در مقاومت گیاهان به بیماری سهیم می¬باشند. در طی آلودگی، فیتوالکسین¬ها ذخیره شده ( معمولاً در سلول یا اندامک¬های خاص ولی به فرم کانژوگه غیرفعال وجود دارند) به جنبش در آمده و همزمان ژن¬های مسیرهای بیوسنتزی آنها فعال می¬شوند و سنتز فیتوالکسین¬های بیشتری شروع می¬گردد. رسوراتزول (Resveratoral) یکی از معمول¬ترین استیلبن¬ها (Stilbene) (فیتوالکسین¬ها) است که در بعضی از گونه¬ها سنتز می¬شود. آنزیم اصلی در سنتز رسوراتزول، آنزیم رسوراترول سنتاز (Resveratrol synthase) است که غالباً به استیلبن سنتاز (Stilbene synthase) معروف می¬باشد.
هین و همکاران (1990) نشان دادند که انتقال یک ژن استیلبن سنتاز (STS) از بادام زمینی به توتون سبب تولید مقادیر قابل اندازه¬گیری از رسوراترول استیلبنی بادام زمینی در توتون می¬شود و اثر سمیت ضدقارچی رسوراترول در گیاهان را اثبات نمودند. ژن STS به برنج و Brassica napus نیز منتقل شده است.

3-4- دستورزی ژن¬های مقاومت به بیماری
تلاش¬ها در زمینه جداسازی ژن¬های مقاومت به بیماری، به لطف توسعه روش¬های کلونینگ مبتنی بر نقشه وعلامتگذاری ژن در چند سال گذشته به پیشرفت قابل توجهی نائل گردیده است. ژن HM1 ذرت، که مقاومت به Cochliobulus carbonum اعطا می¬کند با استفاده از علامت¬گذاری ترانسپوزون (transposon tagging) کلون شده است (Johal and Briggs 1992). این ژن آنزیم HC- توکسین رودکتاز (HC-toxin reductase) وابسته به NADPH را کد می¬نماید که سم قارچی HC را غیرفعال می¬سازد. ژن¬های مقاومت نظیر RPs2 و RPM1 از آرابیدوپسیس، Pto،Cf9، Cf4 و Cf2 از گوجه فرنگی، ژنN توتون، L16 کتان و Xa21 برنج کلون شده¬اند. تعدادی از ژن¬های غیربیماریزا شامل Avr9، Avr4 و غیره نیز کلون گردیده¬اند.
انتقال ژن مقاومت (R) از یک واریته گیاهی مقاوم به یک پاتوژن خاص به واریته حساس، یک راهکار اصلاحی است. مارتین و همکاران (1993)، گیاهان گوجه فرنگی با ژن مقاومت Pto تولید نمودند که به seudomonas syringae pv. tomato مقاومت ایجاد می¬نماید. گیاهان توتون تراریخت برای Pto، به Pseudomonas syringae pv. tabaci بیان کننده avrPto مقاوم شدند. ژن Xa21 برنج به بیش از 30نژاد مختلف باکتری Xanthomonas oryzae عامل بادزدگی برگ برنج مقاومت ایجاد می¬نماید. سانگ (Song) و همکاران (1995) گیاهان تراریخت برنج مقاوم به Xanthomonas بیان کننده avrX21 را تولید نمودند.

مقاومت به تنش¬های غیرزنده
تقریباً تمام تنش¬های غیرزنده نظیر خشکی، سرما و شرایط قلیایی اثر منفی بر رشد داشته و سبب القاء پیری، مرگ سلولی و یا کاهش عملکرد گیاه می¬شوند. تعدادی از تنش¬های غیرزنده همچون خشکی، شوری و دمای خیلی بالا و یا خیلی پائین درای پیامد مشترکی یعنی کمبود آب سلولی و یا تنش اسمزی می¬باشد. از این¬رو، پاسخ گیاهان به کمبود آب، سنتز و تجمع ترکیباتی با وزن مولکولی کم بنام حفاظت کننده¬های اسمزی (Osmoprotectants) است. این حفاظت کننده¬های اسمزی، پتانسیل اسمزی درون سلول¬ها را کاهش داده و به حفظ تورژسانس سلولی کمک می¬نمایند. محلول¬های سازگار شامل گروه متنوعی از ترکیبات متعددی از قبیل یونهای غیرآلی، یونهای آلی، کربوهیدراتهای محلول شامل پلی ئولها (Polyols) ( قندها، الکلها)، اسیدهای آمینه (پرولین) و ترکیبات آمونیوم چهارگانه نظیر گلایسین بتائین را در بر می¬گیرند. چندین ژن گیاهی که آنزیم¬های کلیدی مسیرهای بیوسنتزی اسمولیت¬هایی همچون الکلها، قندها، گلایسین بتائین و پرولین را کد می¬نمایند کلون شده¬اند.
همبستگی شدیدی بین تجمع پرولین با تحمل به شرایط تنش خشکی و شوری گزارش شده است. گاما- پیرولین- 5- کربوکسیلات سنتتاز (P5CS) (γ-pyrroline-5- carboxylate synthethase)، آنزیم محدود کننده سنتز پرولین است. گیاهان توتون تراریخت با آنزیم P5CS تولید شدند که بیان بالایی از این آنزیم و 18-10 برابر پرولین بیشتر را نشان دادند. افزایش غلظت پرولین با افزایش رشد در شرایط خشکی و شوری همبستگی داشت (Kishore et al. 1995). توانایی سنتز و تجمع گلایسین بتائین یکی از قابلیت¬های گسترده بازدانگان است که در تحمل به خشکی و شوری نقش دارد. سنتز گلایسین بتائین در گیاهان توسط اکسیداسیون دو مرحله¬ای کولین (Choline) از طریق بتائین آلدئید ( ماده واسط) صورت می¬گیرد. این واکنش توسط کولین مونواکسیژناز (CMO) (Choline monooxygenase) و بتائین آلدئید دهیدروژناز (BADH) کاتالیز می¬شود. گیاهان تراریخت توتون، آرابیدوپسیس و برنج با BADH، افزایش مقاومت به شوری را نشان دادند. یک ژن باکتریایی E.coli بنام mt1D که در بیوسنتز مانیتول سهیم است به توتون انتقال داده شد و گیاهان تراریخت تولید کننده مانیتول، ارتفاع ساقه بیشتر و انشعابات ریشه¬ای جدید و طویل¬تری داشتند، در حالیکه ریشه¬های گیاهان شاهد قهوه¬ای شده و طویل شدن یا منشعب شدن در آنها رخ نداد. اگرچه بهبود مقاومت در حدی نبود که قابل کاربرد در کشاورزی باشد، ولی این اولین مثال از یک گیاه تراریخت با ژن میکروبی بود که مقاومت بیشتری را به تنش¬های اسمزی نشان داد ( Traczynski et al. 1993). تغییر دیگری در مقاومت به تنش اسمزی، در گیاهان توتون مهندسی شده برای بیان یک ژن باکتریایی که در بیوسنتز فروکتان (Fructan) نقش دارد، گزارش شده است (Pilons-Smith et al. 1995). گیاهان تراریخت ذخیره کننده فروکتان، وقتی¬که با تنش خشکی با استفاده ار 10% PEG در کشت هیدروپونیک مواجه گردیدند، سرعت رشد سریعتری را نشان دادند. تنش اسمزی، تجمع مجموعه¬ای از پروتئینهای با وزن مولکولی کم بنام پروتئین¬های محافظ (Dress proteins) نظیر LEAها را در بافت¬های گیاهی تحریک می¬نماید. یک ژن lea از جو بنام HVAI حفاظت از تنش را در برنج تراریخت نشان داد (Xu et al. 1996).

مقاومت به علفکش
کاربرد علفکش¬ها برای کنترل علفهای هرز در کشاورزی مدرن نقش بسزایی دارد. تلاش¬های زیادی در چندین آزمایشگاه برای مهندسی گیاهان مقاوم به علفکش صورت گرفته است. در مقاومتی که توسط یک ژن کنترل می¬شود پیشرفت حاصل شده است. برای ایجاد گیاهان مقاوم به علفکش سه راهکار مورد استفاده قرار گرفته است: (1) تولید بیش از حد هدف بیوشیمیایی حساس به علفکش، (2) تغییر ساختمانی هدف بیوشیمایی بطوری که منجر به کاهش اثر گذاری علفکش شود و (3) سمیت زدایی و تجزیه علفکش قبل از رسیدن آن به هدف بیوشیمیایی درون سلول گیاهی مقاومت به علفکش¬های گلیفوسیت و سولفونیل اوره، با استفاده از ژن¬های کد کننده آنزیم¬های هدف جهش یافته، به ترتیب برای 5- انول پیروویل شیکیمات- 3 – فسفات سنتتاز (EPSPS) و استولاکتات سنتاز (ALS) بدست آمده است. این دو آنزیم در مسیرهای بیوسنتز اسیدهای آمینه فعالیت می¬نمایند. مقاومت به گلیفوسیت با استفاده از ژن gox که علفکش را خنثی می¬نماید، ایجاد شده است. این ژن از یک نژاد باکتریایی آکروموباکتر جداسازی گردیده است. گیاهان مقاوم به گلیفوسینات آمونیوم با استفاده از ژن¬های باکتریایی کد کننده فسفینوتریسین استیل ترانسفراز (PAT) که فسفینوتریسین را به فرم استیله تبدیل می¬نماید، تولید شده¬اند.
گیاهان تراریخت مقاوم به علفکش¬های متعددی نظیر فسفینوتریسین (بیالوفوس)، گلیفوسیت، سولفونیل اوره، ایمیدازولینونها، بروموکسنیل، آترازین، توفوردی، ستوکسیدیم و غیره در گونه¬های مختلفی از گیاهان زراعی، سبزیجات و گیاهان زینتی و باغی تولید گردیده است. گیاهان تراریخت مقاوم به علفکش در گیاهان زراعی متعددی گزارش شده¬اند، اما در پنبه، کتان، کلزا، ذرت و سویا، این گیاهان تا به حال برای کشت وکار در سطح تجاری تولید شده¬اند و این فهرست به سرعت در حال گسترش است. گیاهان زراعی تراریخت مقاوم به علفکش، 55% از سطح جهانی در حدود 8/12 میلیون هکتار، تحت پوشش گیاهان تراریخت را در سال 1997 به خود اختصاص داده بودند. بخش عمده این سطح 55 درصدی به سویای مقاوم به علفکش (40%) و کلزا (10%) اختصاص داشت و سهم پنبه و ذرت به ترتیب 3% و 2% بود (James 1997).

تولید گیاهان تراریخت برای بهبود کیفیت
1) گیاهان تراریخت برای بهبود کیفیت انباری
اولین موفقیت فروش تجاری یک فراورده غذایی، برای گوجه فرنگی تراریخت فلاور ساور با تاخیر در رسیدگی میوه بود که توسط شرکت کالژن ایالات متحده آمریکا در سال 1994 تولید شد. بهبود کیفیت ذخیره¬سازی یا عمر قفسه¬ای طولاتی تر گوجه فرنگی که یک ویژگی مطلوب در فن آوری غذایی است با استفاده از دو راهکار امکانپذیر است: (1) تکنولوژی RNA آنتی سنس و (2) استفاده از ژن آمینو سیکلوپروپان- 1- کربوکسیلیک اسید (ACC) دآمیناز را به اتیلن تجزیه می¬نماید. کالژن از RNAی آنتی سنس مکمل ژن کد کننده آنزیم پلی گالاکتوروناز (PG) استفاده کرد. بر اساس توالی ژن PG، یک ژن PG آنتی سنس ساخته شد و گیاهان گوجه فرنگی توسط آن تراریخت شدند. این گیاهان گوجه فرنگی تراریخت، هر دو نوع RNA سنس و آنتی سنس را برای ژن PG تولید نمودند که منجر به جفت شدن RNA-RNA شد. این امر منجر به عدم تولید فراورده ژن PG شد. بدین ترتیب از حمله ژن PG به پکتین دیواره سلول¬های میوه در حال رسیدن و در نتیجه از نرم شدن میوه ممانعت بعمل آمد. کالژن، گوجه فرنگی تراریخت خود را رقم مک گریگور نامید و بر اساس اظهارات شرکت، این گوجه فرنگی بدون نرم شدن قادر است دو هفته بیشتر در قفسه فروشگاه دوام بیاورد.
هورمون گیاهی اتیلن، نقش عمده¬ای در فرایند رسیدن میوه¬ها و پیری گل¬ها بر عهده دارد. در بیوسنتز اتیلن، دو آنزیم ACC سینتاز (ACS) و ACC اکسیداز (ACO) به ترتیب تبدیل اس- آدنوزین متیونین (SAM) به 1- آمینو سیکلوپروپان- 1- کربوکسیلیک اسید (ACC) و تبدیل (ACC) به اتیلن را کاتالیز می¬نمایند. ژن¬های کد کننده ACS و ACO (aco, acs) از گونه¬های زیادی کلون شده¬اند. شرکت مونسانتو، مشکل کنترل اتیلن را با تولید گوجه فرنگی¬های مهندسی شده ژنتیکی برای بیان یک ژن از باکتریهای Pseudomonas مرتفع ساخت. آنزیمی که این ژن کد می¬نماید قادر است ACC را به متابولیت¬های غیر از اتیلن تبدیل نماید (Klee 1993) که در نتیجه مثل RNAی آنتی سنس منجر به تاخیر در رسیدن میوه می¬شود. به طور مشابه، تولید اتیلن در گوجه فرنگی توسط بیان بیش از حد ژن کد کننده SAM هیدرولاز که از باکتریوفاژ T3 جداسازی گردیده است، کاهش داده شد. شرکت¬های متعددی همچون ذنکا، تکنولوژی DNA گیاهی امریکا، مونسانتو، پیونر- برد و لیماگریانزویلمورین در حال تولید گوجه¬های فرنگی تراریخت و غیر تراریخت به منظور افزایش طول عمر قفسه¬ای می¬باشند.
2) گلهای تراریخت با عمر بییشتر
عمر پس از برداشت بسیاری از گل¬ها، با شروع پیرشدن گلبرگها مشخص می¬گردد. مشخصه پیرشدن گلبرگها در میخک پیچ خوردن آنها است. پیچ خوردگی برگ¬ها در پاسخ به منابع اتیلن خارجی نیز مشاهده می¬شود (Cornish 1995). ساوین و همکاران (1994)، با استفاده از یک کلون cDNA برای ACC اکسیداز (aco)، میخک¬های تراریختی تولید کردند که از بیان ACC اکسیداز آنتی سنس برخوردار بوده و گل¬هایی با اتلین بسیار اندک تولید نمودند. این عمل، عمر گلدانی گل¬ها را تا 200 درصد افزایش داد. تنها گل بریده¬ای که تا سال 1997، تائیدیه آزادسازی در سطح تجاری دریافت نمود، میخک طویل العمر برای آزمایشات مزرعه¬ای در هلند و آزمایشات گلخانه¬ای در ایالات متحده آمریکا صادر گردیده است. گیاهان میخک طویل العمر تراریخت با ژن سنس acs نیز در استرالیا تائیدیه کشت دریافت نموده¬اند.

3) گیاهان تراریخت برای رنگ گل
از آنجا که مصرف کنندگان گل¬ها جذب محصولات جدید می¬شوند، رنگ گل مد نظر بیوتکنولوژی قرار گرفته است. آنتوسیانین¬ها رنگدانه¬های اصلی گل در گیاهان عالی می¬باشند. تولید گل¬های آبی¬رنگ در گونه¬های نظیر رز و میخک که این رنگها بطور طبیعی در آنها پدید نمی¬آیند، یکی از اهداف اصلی بوده است. دلفینیدین یک رنگیزه آنتوسیانینی است که معمولاً منجر به ایجاد رنگ آبی می¬شود. یک گروه تحقیقاتی از فلوریژن در استرالیا، ژنی را از Petunia hybrida شناسایی و کلون نمودند که یک فلاونوئید ´3 و '5 هیدروکسیلاز را کد می¬نماید که برای بیوسنتز دلفینیدین ضروری است ( Stevenson and Cornish 1993). این تغییر، اطلاعات مهم و ضروری را برای تولید گیاهان تراریخت با گل¬های حاوی رنگیزه¬های آبی فراهم می¬آورد.گستره¬ای از میخک¬های بنفش مهندسی شده ژنتیکی در مرحله آزاد سازی تجاری قرار دارند.

4) گیاهان تراریخت برای نرعقیمی
نرعقیمی در گیاهان هم به صورت ژنتیکی هم به صورت سیتوپلاسمی توارث می¬یابد. نرعقیمی سیتوپلاسمی (cms) بدلیل نقص در ژنوم میتوکندریایی می¬باشد. معمولاً cms با نقص در عملکرد بافت مغذی بساک مرتبط است که مواد مغذی را به دانه¬های گرده در حال نمو می¬رساند. بخش¬های ماده این گیاهان، باروری خود را حفظ می¬نمایند. گیاهان تراریخت با نرعقیمی و تجدید باروری در Brassica napus تولید شده¬اند (Mariani et al. 1990). در توتون نیز، با استفاده از یک ژن جهش یافته میتوکندریایی نرعقیمی وارد شده است. این عمل با انتقال یک ژن ریبونوکلئاز صورت گرفت. یک ژن هیبرید با یک توالی کدکننده ریبونوکلئاز و یک پروموتور اختصاصی بافت تغذیه کننده ساخته شد. ماریانی و همکاران (1990) یک ساختار ژنی ساختند که دارای یک پروموتور اختصاصی بساک از ژن TA29 توتون و یک توالی باکتریایی کد کننده ریبونوکلئاز از ژن Barnase باکتری Bacillus amylolique facines بود. فراورده ژن Barnase یک آنزیم نوکلئاز است که سمیت سلولی ایجاد نموده و فقط سلول¬های بافت تغذیه کننده را از بین می¬برد. بدین ترتیب از نمو دانه گرده ممانعت نموده و سرانجام منجر به نرعقیمی می¬شود. با استفاده از این ساختار ژنی (TA-29-RNase)، در توتون، کاهو، گلکلم، پنبه، گوجه فرنگی و ذرت گیاهان تراریخت نرعقیم تولید شده است. معذالک محدودیتی که برای این این روش وجود دارد این است که گیاهان تراریخت از نرعقیمی دائمی برخوردارند و تلاقی با یک لاین تجدید کننده باروری، نرباروری را در آنها تجدید نمی¬نماید. بعدها گزارش شد که تلاقی این گیاهان تراریخت با یک گروه دیگر از گیاهان تراریخت که یک ژن شیمری بازدارنده ریبونوکلئاز تحت کنترل یک پروموتور اختصاصی بافت تغذیه کننده درآانها بیان می¬شد، می¬تواند نرباروری را در آنها تجدید نماید. ماریانی و همکارائ در تحقیق دیگری (1992)، ساختار ژنی Barstar را از Bacillus amyloliguifacienes با پروموتور TA-29 برای تولید گیاهان تراریخت نربارور در B.napus مورد استفاده قرار دادند. فراورده ژن Barstar، یک بازدارنده ریبونوکلئاز است که با آنزیم ریبونوکلئاز تشکیل کمپلکس می¬دهد و اثر سمیت سلولی آن را خنثی می¬نماید. وقتی که گیاهان نرعقیم (ژن Barnase) با گیاهان نربارور (ژن Barstar) تلاقی داده شدند، گیاهان F1 بدلیل تجدید باروری حاصل از توقف فعالیت سمیت سلولی ریبونوکلئاز در بساک¬ها در اثر تشکیل کمپلکس RNase/ بازدارنده RNase بارور شدند. این سیستم برای تولید بذر هیبرید مورد استفاده قرار گرفت.

گیاهان تراریخت برای بذر خاتمه دهنده
به آن تکنولوژی که قابلیت حیات یا باروری بذور را پس از یک مدت معین خاتمه می¬دهد، به آن تکنولوژی خاتمه دهنده و به ژن دخیل در این پدیده ژن خاتمه دهنده می¬گویند. تکنولوژی خاتمه دهنده، به دلیل حق انحصار (شماره 5723765) بر" کنترل بیان ژن گیاهی" که توسط اداره ثبت انحصارات ایالات متحده در سوم مارس 1998 برای سازمان کشاورزی ایالات متحده آمریکا و شرکت آمریکایی دلتا و پین لند صادر گردید، توجه زیادی را به خود جلب نموده است. این حق انحصار برای هر ژن جدیدی نبود، بلکه برای ژن¬های معینی صادر و برای کنترل مکانیزم¬هایی جهت خاتمه دادن به بیان صفات مورد نظر در نسل اول یا نسل¬های بعدی گیاهان اعطا شد.
تکنولوژی خاتمه دهنده، مبتنی بر استفاده از یک ژن کشنده مناسب است که بذور نسل دوم را نابارور می¬نماید. شرکت تولید کننده، بذور نسل اول را می¬فروشد که از رشد و نمو و باروری طبیعی بطور کامل برخوردار بوده و گیاهانی سالم با قابلیت تولید بذر و یا میوه تولیئ می¬نمایند، اما بذور و یا میوه¬های حاصل از این گیاهان فقط به عنوان غذا قابل استفاده هستند و اگر کشت شوند جوانه نخواهند زد. این پدیده، کشاورزان را مجبور به خریداری بذور تازه از کمپانی بذر برای فصل زراعی بعدی می¬نماید، زیرا که آنها قادر به استفاده از بذور برداشت شده برای کشت در فصل زراعی بعدی نیستند.
تکنولوژی خاتمه دهنده از سه قطعه DNA یا ژن که اطلاعات ژنتیکی ضروری راحمل می¬کند، برای انتقال به گیاهان استفاده می¬کند.

1- ژن خاتمه دهنده (ژن کشنده)
هر ژنی که بتواند یک پروتئین سمی ممانعت کننده از جوانه¬زنی بذر را در گیاهان تولید نماید می¬تواند به عنوان ژن خاتمه دهنده مورد استفاده قرار گیرد. یک ژن کشنده، پروتئین بازدارنده ریبوزوم (RIP) را کد می¬نماید. ژن کشنده کد کننده RIP، در فرایند سنتز پروتئین¬ها در سلول گیاهی اختلال ایجاد می¬کند، بدون آنکه برای دیگر موجودات سمی باشد. بنابراین بیان ژن RIP در سلول¬های جنین، از جوانه¬زنی بذر ممانعت خواهد کرد. این ژن به یک نوع خاص از پروموتور که در مراحل پایانی نمو بذر فعال می¬شود، متصل می¬گردد. وقتی که هدف، بیان صفت مذبور در نسل دوم بذور باشد، پروموتور LEA ایده¬ال است. چنین پروموتوری فقط پس از کامل شدن رشد رویشی گیاهان نسل اول فعال می¬شود. برای ممانعت از بیان ژن RIP کشنده در بذر نسل اول، یک توالی بلوکه کننده نیز توسط توالی برشی خاصی (مکان¬های LOX) ساقدوشی می¬شود. وقتی که با ایجاد برش های مکان اختصاصی در مکان¬های LOX مجاور، توالی بلوکه کننده از جایگاه خود خارج می¬شود، ژن کشنده مستقیماً با پروموتور تماس می¬یابد و بدین ترتیب در تمام نسل¬های بعدی در طی مراحل پایانی جنین¬زایی بروز می¬نماید.

2- ژن رکومبیناز
ساختار ژنی دوم، شامل یک ژن که آنزیمی بنام رکومبیناز را کد می¬نماید. این آنزیم قادر به شناسایی توالی¬های برشی LOX و حذف این توالی¬ها همراه با توالی بلوکه کننده از ساختار ژنی اول از طریق فرایند نوترکیبی است. یک سیستم توالی برشی رکومبیناز ترجیحی سیستم LOX/ CRE باکتریوفاژ است که در آن، پروتئین CRE (رکومبیناز) نوترکیبی مکان اختصاصی DNA را در مکان¬های LOX انجام می¬دهد. این ژن رکومبیناز پشت یک پروموتور متوقف شونده مخصوص یک بازدارنده که توسط ژن سوم کد می¬گردد، قرار داده می¬شود. این پروموتور می¬تواند متوقف شود و بدین ترتیب اگر یک پروتئین خاص در محیط وجود داشته باشد، آنزیم رکومبیناز تولید نمی¬شود.

3- ژن متوقف کننده
یک ژن سوم، پرتئینی به نام پرتئین بازدارنده را کد می¬نماید که پروموتور ژن رکومبیناز را در ساختار ژنی دوم متوقف می¬نماید. خود پروتئین بازدارنده به یک ماده شیمیایی خاص (تتراسایکلن) متصل شود، غیر فعال می¬گردد. بازدارنده غیرفعال ( یعنی کمپلکس بازدارنده – تتراسایکلن) قادر به متوقف ساختن پروموتور متصل شده به ژن رکومبیناز نبوده و بدبن ترتیب امکان سنتز آنزیم رکومبیناز فراهم می¬شود.

گیاهان تراریخت به عنوان بیوراکتور
به واسطه تکنیک مهندسی ژنتیک، ترکیباتی با ارزش تجاری که قبلاً فقط از منابع گیاهی وحشی و یا منابع حیوانی و میکروبی تامین می¬گردند، امروزه از طریق تکنیک مهندسی ژنتیک در گیاهان اهلی تولید می¬شوند. گیاهان تراریخت می¬توانند به عنوان بیوراکتورهای زنده برای تولید ارزان موادشیمیایی و دارویی عمل نمایند که این پدیده به زراعت مولکولی معروف می¬باشد. با استفاده از روش زراعت مولکولی می¬توان کربوهیدراتها، اسیدهای چرب، پلی پپتیدها، واکسن¬ها، آنزیم¬های صنعتی و پلاستیک¬های قابل تجزیه زیستی را در سیستم¬های گیاهی تولید نمود.

کربوهیدراتها
نشاسته یکی از اجزای سلول¬های گیاهی است. نشاسته¬های مهندسی شده با مقدار آمیلوز کاهش یافته یا مقدار نشاسته افزایش یافته در سیب زمینی تائید شده¬اند. همچنین پیش سازه¬های نشاسته¬ای نیز مجدداً در جریان مسیرهای بیوسنتزی کربوهیدراتهای ذخیرهای دیگر قرار داده شده¬اند. گیاهان توتون و سیب زمینی که توانایی ذخیره فروکتان را نداشتند، برای تجمع فروکتان، با ژن فروکتوزیل ترانسفراز از Bacillus subtilis تراریخت شده¬اند. تلاش¬هایی نیز برای تولید ترکیبات جدید از طریق مهندسی ژنتیک صورت گرفته است. گیاهان توتون، با ژن مانیتول -1 – فسفات دهیدروژناز (mt1D) از E.coli تراریخت شدهاند. این تراریخت¬ها مقدار مانیتول بیشتری تولید نموده و به سطوح بالای شوری تحمل نشان داده¬اند (Tarczynski et al. 1993). به طور مشابه، ژن میو اینوزیتول- متیل ترانسفراز از Mesembryanthemum crystallinum (گیاه یخ) به توتون انتقال داده شده است، دراین گیاه موجب تولید پینیتول که یک الکل قندی حلقوی مشتق شده از میواینوزیتول است، در این گیاه شود. ترهالوز، یک افزودنی خوراکی می¬باشد که کیفیت غذاهای خشک و فراوری شده را با خوشمزه¬تر نمودن آنها بهبود می¬بخشد. شرکت¬های بیوتکنولوژی گیاهی، موگن (در لیدن هلند) و کالژن (در دیویس ایالات متحده) سنتز مقدار اندکی ترهالوز را در گیاهان توتون تراریخت گزارش نموده¬اند.

چربیها
افزایش مقدار اسید چرب اشباع نشده تک ظرفیتی در گیاهان به دلیل افزایش کیفیت غذایی روغن¬ها یک صفت مطلوب می¬باشد. وقتی که یک ژن دساتوراز از موش صحرایی به توتون منتقل شد، در گیاهان تراریخت مقدار اسید پالمیتولئیک و اسید اولئیک به ترتیب به نسبت 16:1 و 18:1 افزایش یافت (Grayburn 1992). برای استفاده در ساخت دترژنت¬ها و همچنین کاربردهای غذایی خاص، ژن تیواستراز از درخت بای کالیفرنیا به آرابیدوپسیس منتقل گردید تا سبب تجمع یک اسید چرب با زنجیره متوسط 12 کربنه به عنوان چربی ذخیره¬ای در این گیاه شود (Voelker 1992). اولین فراورده غیر خوراکی حاصل از مهندسی زیستی گیاهی که در سطح تجاری تولید گردید، یک واریته کلزای مهندسی شده ژنتیکی که برای تولید اسید لوریک، یک اسید چرب 12 کربنه مورد استفاده در ساخت صابون¬ها و دترژنت¬ها تغییر داده شد. بدین منظور محققین فقط به انتقال یک ژن از درخت بای کالیفرنیا نیاز داشتند. این ژن، فرایند سنتز اسید چرب را در مرحله 12 کربنه متوقف نموده و اجازه رشد زنجیره تا مرحله 18 کربنی را که وضعیت عادی برای گیاه است نمی¬دهد و در عین حال، تاثیر چندانی بر عملکرد ندارد.

پلاستیک قابل تجزیه زیستی
گیاهان تولید کننده پلاستیک تجاری نیز چند سالی بیشتر با ما فاصله ندارند، اگرچه محققان در این زمینه در حال پیشرفت می¬باشند. پلی هیدروکسی بوتیرات (PHB) که یک پلی استر آلفاتیک با خصوصیات ترموپلاستیک می¬باشد، در ابتدا با انتقال ژنهای مرتبط با استواستیل- کوآنزیم A ردوکتاز و PHA سنتاز از باکتری Alcaligenes euthophus به Arabidopsis thaliana در گیاهان تولید شد. اگرچه گیاهان تراریخت حاصله ناسالم بوده و مقدار کمی PHB تولید نمودند، اما انتقال اولیه ژن، مؤثر واقع شد. این مشکل با اضافه کردن یک توالی به ژن که سبب می¬شود آنزیم¬های تولیدی، وزیکول¬های ذخیره¬ای یعنی پلاستیدها را مورد هدف قرار دهند، مرتفع گردید. با انجام این کار، هم مقادیر فراوانی از یک ترکیب پیش ساز اصلی برای سنتز PHB در اختیار آنزیم¬ها قرار می¬گرفت و هم سلول گیاهی از اثرات مضر احتمالی تجمع PHB در امان می¬ماند. در نتیجه، سنتز PHB، بدون اثرا ناخوشایند بارزی بر رشد گیاه یا عملکرد بذر، به میزان 10 برابر افزایش یافت (Poirire et al. 1995).

پروتئینها، پپتیدها و واکسنها
امروزه پیشرفت¬های جدید در بیوتکنولوژی گیاهی این تصورات را در اذهان منعکس می¬نماید که احتمالاً می¬توان از گیاهان مهندسی شده ژنتیکی و ویروس¬های گیاهی برای تولید واکسن بر علیه بیماریهای انسانی، از پوسیدگی دندان گرفته تا عفونتهای تهدید کننده زندگی از قبیل اسهال باکتریایی، وبا و ایدز، استفاده نمود. یکی از اولین موارد برتی تولید پپتیدهای دارویی در گیاهان، از بیان فراوان پروتئین ذخیره¬ای بذر در حالت طبیعی استفاده نمود. پپتید عصبی انکفالین، به عنوان بخشی از آلبومین s2 پروتئین ذخیره¬ای بذر در B.napus تولید می¬شد ( Krebbers and kerckore 1990). ناقلین ویروسی برای تولید پروتئین¬های پوششی شیمری در گیاهان تراریخت مورد استفاده قرار گرفته¬اند. تورپن و همکاران (1995)، روشی را برای مهندسی پرتئین کپسید ویروس TMV بصورت تلفیق¬های درونی یا تلفیق در انتهای C، با پپتیدهای حامل اپیتوپ مشتق شده از اسپوروزیت¬های مالاریا شرح دادند. هر دو نوع ساختار تلفیق درونی و تلفیق در انتهای C، مقادیر فراوانی از ویروس¬های نوترکیب با ثبات ژنتیکی تولید نمودند که در توتون آلوده آنتی بادیهای مونوکلونال ضد مالاریایی مناسب تولید کردند. پروتئین زونا پلوسیدا ZP3 با پروتئین کپسیدی ویروس TMV ترکیب شده¬اند. پروتئین ZP3 اووسیت پستانداران به عنوان هدف برای ایمنی از باروری و یک اپیتوپ 13 اسید آمینه¬ای از ZP3 موشی، به صورت ترکیب با پروتئین کپسید ویروس TMV در گیاهان بیان شده¬اند. موش¬های ایمن شده با ذرات TMV نوترکیب، آنتی بادیهای ضد ZP3 را تولید نمودند. از نظر تئوری، واکسیناسیون با پروتئین پوششی ویروسی تغییر یافته می¬تواند به عنوان یک روش کنترل تولید مثل عمل نماید، زیرا آنتی¬بادیهای زونا پلوسیدا قادر به ممانعت از باروری تخم می¬باشد. چنین مطلبی نیز برای اپیتوپ¬های مشتق شده از ویروس¬های نقص ایمنی انسان که به صورت محصولات تلفیق پروتئین¬های پوششی ویروس موزائیک یونجه بیان می¬شوند، صحیح است (Yushibor et al. 1997). ویروس موزائیک لوبیای چشم بلبلی نیز به عنوان یک سیستم بیان برای تولید پپتیدهای خارجی نظیر اپیتوپ مشتق شده از رینوویروس 14 انسان و ویروس نقص ایمنی انسان (HIV) مهندسی شده است. ویروس¬های گیاهی تغییر یافته، تولید آنتی¬بادیی را در موش تحریک نمودند که ویروس را در آزمایشات درون لوله آزمایش خنثی نمودند (McLein et al. 1995). این نتیجه، احتمال تولید واکسن ممانعت کننده از HIV را نشان می¬دهد. پروتئین¬های پوششی تلفیقی می¬توانند به عنوان یک روش مقرون بصرفه برای تولید واکسن¬ها مد نظر قرار گیرند.

تولید واکسنهای خوراکی
گیاهان تراریخت نقاط امیدی از سیستم¬های تولید واکسن کم هزینه را نشان می¬دهند. محققین روش¬های مختلفی را برای تولید واکسن¬های گیاهی اعمال می¬نمایند، اما واکسن¬های خوراکی که در حال حاضر توسط یک گروه تحقیقاتی به رهبری چارلز آرنتزن از دانشگاه A&M تگزاس در ایالات متحده در حال تولید هستند، احتمالاً ارزانترین نوع می¬باشند که به راحت¬ترین شکل قابل توزیع هستند. ایده حامی واکسن¬های خوراکی این است که افراد، بعنوان بخشی از جیره غذایی خود، با خوردن گیاهانی که واکسن را تولید می¬کنند، دز مورد نیاز خورد را دریافت نمایند. گروه آرنتزن، کار خورد را با هدف تولید واکسن¬های خوراکی برای پیشگیری از بیماریهای رودهای همچون وبا و اسهال که توسط باکتریهایی از قبیل E.coli، Shigella و Samonella ایجاد می¬شوند، شروع کرد. اسهال باکتریایی مهمترین عامل مرگ و میر کودکان در کشورهای در حال توسعه است. اولین گزارش از اصل بکارگیری یک سیستم بیان گیاهی برای تولید یک واکسن خوراکی در یک نشریه تحت معاهده همکاری حق انحصار بین الملل انتشار یافت که روشی را برای بیان یک پروتئین سطحی (spa) از Streptomyces mutans در توتون تا 2% از کل پروتئین برگ شرح داد. آنتی ژن سطحی هپاتیت B (HBsAg) در توتون بیان گردیدهاست (Mason et al. 1992) هرچند که میزان بیان آن اندک بوده است (01/0 درصد از پروتئین محلول). ایمنی به HBsAg در موش آزمایشگاهی تائید شده است.
گیاهان توتون و سیب زمینی تراریخت بیان کننده زیر واحد B انتروتوکسین حساس به گرما از E.coli با یک توالی نگهدارنده میکروزومی نیز تولید شده¬اند (Haq et al. 1995). گیاهان تراریخت، پپتید خارجی را بیان نمودند و وقتی¬که موشها از غده¬های سیب زمینی تراریخت تغذیه شدند، ایمنی خوراکی در آنها پدیدار گشت. این آزمایش سهولت استفاده از گیاهان تراریخت بعنوان سیستم¬هایی برای بیان و توزیع واکسن¬های خوراکی را ترسیم می¬نماید. واکسن خوراکی گیاهی ضد اسهال که در سیب زمینی بیان می¬شوند، مدتی است که در مرحله آزمایشات انسانی قرار دارد (Tacket et al. 1998). یکی از مشکلاتی که در مورد سیب زمینی وجود دارد این است که بایستس قبل از مصرف، پخته شود. درجه حرارت طبخ ممکن است سبب دناتوره شدن پرتئین واکسن یا کاهش یا حذف توانایی آن در ایجاد ایمنی گردد.
معذالک مشکل سیب زمینی با متوسل شدن به موز که بصورت خام خورده می¬شود، ممکن است به زودی حل شود. آرنتزن و همکارانش، یک ژن بیگانه را به درختان موز منتقل نموده و بیان آن را نیز به اثبات رسانده¬اند. آنها در این آزمایش از ژن مولد پروتئین واکسن استفاده نکردند، اما قصد انتقال ژن انتروتوکسین E.coli را به موز دارن که اگر با موفقیت همراه شود می¬خواهند ژن¬هایی را برای پروتئین¬های واکسنی دیگر به موز منتقل نمایند.
بنابراین گیاهان تراریخت این نوید را داده¬اند که بعنوان سیستم¬های کم هزینه برای تولید واکسن بکار روند. تلاش¬های قابل توجهی در جهت بیان تعداد زیادی از پروتئین¬های مورد استفاده در واکسن درمانی به مقادیر زیاد در گیاهان و استفاده از گیاهان به عنوان بیوراکتورهای عصر مدرن در حال انجام است.


چشم انداز آینده
در حالیکه کمتر شکی در مورد مدرن بودن بیوتکنولوژی وجود دارد، بدون شک این فن آوری یک مد زودگذر نیست. انتظارات ایجاد شده برای توسعه تجاری مقاومت به علفکش¬ها و حشرات، آینده درخشانی را برای بیوتکنولوژی کشاورزی خاطر نشان می¬نماید. با توجه به شواهد اولیهای که در مورد استفاده از انتقال ژن¬های جدید به منظور ایجاد لاین¬های گیاهی سودمند برای تولید مواد شیمیایی از مواد دارویی گرفته تا پلاستیک¬های قابل تجزیه زیستی وجود دارد، چشم انداز آینده این تکنولوژی نیز امیدوار کننده است. بیوتکنولوژی کشاورزی در مسیر خود از شروع بکار بیوتکنولوژی تا تولید مزرعهای محصولات تجاری، با موانع متعددی از محدودیت¬های علمی و تکنولوژیکی، تا مشکلات قانونی و مدیریتی، عوامل اقتصادی و نگرانی¬های اجتماعی روبرو می¬باشد. فرضیه محافظه کارانه قوانین در اکثر کشورها این است که تمام گیاهان تراریخت بطور بالقوه خطرناک هستند. خطرات احتمالی، مرتبط با ژن منتقل شده و یا فنوتیپ ایجاده شده است نه روش¬های مورد استفاده برای انتقال ژن. تا کنون گزارشی در مورد اثرات مضر محیطی و یا دیگر خطرات پیش بینی نشده گیاهان تراریخت در هزاران آزمایش مزرعه¬ای صورت گرفته در عرصه بین المللی ارائه نگردیده است. با این حال، نگرانی¬های متعددی دررابطه مستقیم با سیستم¬های کشاورزی ایجاد شده است. بعنوان مثال، استفاده از ژن¬های مقاومت منشاء گرفته از ویروسها نگرنی¬هایی را در مورد احتمال نوترکیبی ویروسی و ایجاد ویروس¬های جدیدی با دامنه میزبانی و شدت علائم تغییر یافته بوجود آورده است. استفاده از مقاومت به حشرات ناشی ار Bt مهندسی شده، نگرانی¬هایی را در مورد تکامل سریع مقاومت در حشرات ایجاد نموده است. دیگران نیز امکان ایجاد مشکلات جدید یا سخت تر در مواجهه با علف هزر را خاطر نشان نموده¬اند. در کشورهای در حال توسعه، بکارگیری تکنولوژی بذر خاتمه دهنده به یک موضوع مهم تبدیل شده است، اما نقاط مورد اختلاف مطرح نگردیده¬اند. اکنون عکس العمل مصرف کننده به محصولات گیاهی تراریخت با آزادسازی تجاری واریته¬های پیشرفته در سطح تجاری سنجیده شده است. این آزاد سازی با افزایش انتشار اطلاعات در مورد گیاهان تراریخت به شکل قابل دسترسی برای عموم، همزمان گردیده است. با این حال همچنان که محدودیت¬های تکنیکی برداشته می¬شوند، این احتمال وجود دارد که محدودیت¬های تجاری به اصلی¬ترین موانع تبدیل گردند. تکنولوژی جدید که در این عرصه خلق می¬گردند کاملاً اختراعی بوده و واجد شرایط احراز حق انحصاری و ملاحظه حقوق مالکین معنوی میباشد

+ نوشته شده در  جمعه 1387/06/15ساعت 0:8 قبل از ظهر  توسط رضا فرجامی نژاد  |