Biotechnology

امتزاج پروتوپلاست و کاربرد آن در اصلاح نباتات

ویسی مال امیری ، ایمان^* و نوشین ارشادی ^**

* کارشناس ارشد اصلاح نباتات، عضو باشگاه پژوهشگران جوان و عضو سازمان نظام مهندسی کشاورزی و منابع طبیعی استان کرمانشاه

** کارشناس زراعت و اصلاح نباتات، عضو سازمان نظام مهندسی کشاورزی و منابع طبیعی استان کرمانشاه 

چکیده :

دورگ گیری سوماتیکی(somatic hybridization ) و امتزاج پروتوپلاست( Protoplast Fusion )درجنس ها وگونه هایی انجام می شود که تلاقی پذیری ندارند. اينكار به منظور دست كاري گونه‌‌هاي گياهي و در جهت افزايش تنوع ژنتيكی و ايجاد صفات و يا گياهان جديد و توليد سيبريدها استفاده مي‌شود. این فنون با رفع محدويت تلاقي‌‌هاي بين‌گونه‌‌اي و بين‌جنسي از طريق كشت تخمك نارس يا بالغ(Invitro  pollination )و با به کارگیری فنون نجات (یاکشت) جنین (embrio rescue) به عنوان مكمل روش‌‌هاي اصلاح سنتي عمل نمايند. دورگ گیری سلولهای سوماتیکی یک فرآیند چند مرحله ای است که شامل جداسازی پروتوپلاستهای گونه های متفاوت، آمیختن پروتوپلاستهای حاصل از دو گونه متفاوت، و کلون کردن پروتوپلاستهای هیبرید مخلوط شده و تجدید نسل گیاهان هیبرید بارور حاصل از پروتوپلاستهای آمیخته است. از جمله صفاتی که در این روش برای انتقال مورد توجه هستند می توان تحمل به تنش های محیطی از قبیل سرما، شوری، خشکی، و مقاومت به آفات و بیماریها را نام برد. ایجاد دورگ گیری سوماتیکی به روش امتزاج پروتوپلاست در بیش از 30 گونه و12 جنس انجام شده است. پومیتو (Pomato) تنها گياه جديدي است كه از طريق امتزاج پروتوپلاست گوجه‌فرنگي و سيب‌زميني تولید شده است ولی هنوز بهره برداری كشاورزي ندارد. 

واژه های کلیدی : دورگ گیری سوماتیکی، امتزاج پروتوپلاست، سيبريد، نجات جنین، پومیتو

مقدمه:

پروتوپلاست سلولی است که دیواره آن بطور کامل حذف شده است. امتزاج پروتوپلاست عبارت است از اخطلاط پروتوپلاستهای گیاهی (سلولهای عاری از دیواره سلولی) از سلولهای سماتیکی گونه های متفاوت و تجدید نسل گیاهان هیبرید حاصل از پروتوپلاست های مخلوط شده می باشد. اولین تلاش موفقیت آمیز در امتزاج پروتوپلاست گل اطلسی توسط پاور و همکارانش (Power et al, 1976 ) در انگلیس و نیز کارلسون و همکارانش (Carlson et al, 1975 ) در آمریکا در تنباکو بود. بعد از جداسازی پروتوپلاست تنها مانع بین سیتوپلاسم و محیط خارجی غشا پلاسما می باشد. فقدان دیواره سلولی باعث برقرار شدن تماس نزدیک غشا پلاسمایی دو یا چند پروتوپلاست می شود که این امکان تحت شرایط طبیعی وجود ندارد وقتی غشا پلاسمایی دو پروتوپلاست با هم تماس می یابند، تحت بعضی شرایط آنها همانند دوحباب صابون به همدیگر خواهند چسبید. بعداً اگرمحرک مناسبی برروی آنها اعمال شود بار دیگر مثل دو حباب صابون با یک دیگرامتزاج یافته و به صورت یک گوی احاطه شده با یک غشا در می آیند. امروزه توجه زیادی برای امتزاج پروتوپلاست به عنوان یک وسیله بهنژادی گیاهان صورت می گیرد. اگرچه نتایج مثبت در این زمینه جهت تولید گیاهان زراعی اصلاح شده خیلی نادراست ولی اشخاص زیادی امتزاج پروتوپلاست را یک وسیله مفید برای اصلاح گران می دانند که آنها می توانند با استفاده از این روش گونه های ناسازگار جنسی را با هم تلاقی داده وصفات هسته ای و سیتوپلاسمی را منتقل نمایند. امتزاج پروتوپلاست را می توان برای تلاقی درون گونه ای، درون جنسی و بین جنسی به کار برد. امتزاج پروتوپلاست ابزاری در جهت نیل به توارث فرا جنسی ژنوم های اندامکی هر دو والد به شمار می رود. در فراورده های الحاقی که هسته ها، پلاستها و میتوکندری های هردو والد در یک سلول حضور دارند، اجتماع تازه ای از هسته یک گونه و اندامکهای یک گونه دور پدید می آید. از طرفی نیز اثرات متقابل درسطح DNA بین ژنومهای اندامکی موجبات خلق ژنوم های جدید موردعلاقه در اصلاح نباتات می شود. امتزاج پروتوپلاست و دورگ گیری سوماتیکی درجنس ها وگونه‌هايي انجام مي‌شود كه تلاقی پذیری ندارند. اينكار به منظور دست كاري گونه‌‌هاي گياهي و درجهت افزايش تنوع ژنتيكی و ايجاد صفات و يا گياهان جديدو توليد سيبريدها (دورگ‌‌های سيتوپلاسمي) استفاده مي‌شود. با توجه به اینکه امتزاج پروتوپلاست برای آمیزش گونه هایی که نمی توان به صورت جنسی تلاقی یابند استفاده می شود، لذا امتزاج پروتوپلاست را دورگ گیری شبه جنسی(parasexual hybridization ) نیز نام گذاری کرده اند. این فنون با رفع محدويت تلاقي‌‌هاي بين‌گونه‌‌اي و بين‌جنسي از طريق كشت تخمك نارس يا بالغ(Invitro pollination )و با به کارگیری فنون نجات (یاکشت) جنین(embrio rescue) به عنوان مكمل روش‌‌هاي اصلاح سنتي عمل نمايند. پومیتو (Pomato) تنها گياه جديدي است كه از طريق امتزاج پروتوپلاست گوجه‌فرنگي و سيب‌زميني تولید شده است ولی هنوز بهره برداری كشاورزي ندارد.

١- امتزاج پروتوپلاست و تبادل سیتوپلاسم ها

درصورتیکه هدف ادغام هسته یک والد با سیتوپلاسم کامل والد دیگر است و درصورتیکه فراوانی دورگ های هسته ای بالا باشد می توان سیتوپلاسم بخشنده را به وسیله اشعه ایکس یا گاما درزمان قبل از امتزاج پرتوتابی کرد. این تیمار هیچ گونه اثرزیان آور برروی ژنوم اندامک های نتاجی که پروتوپلاست آنها تابش دیده ندارد ، زیرا ژنوم ها تکرار زیادی دارند. برای اینکه صرفاً اندامک های سیتوپلاسمی والدپرتو دیده نگهداری شود. مجیسی و همکاران برای حذف اندامکهای والد دیگر، استفاده از روش باز دارندگی متابولیکی که برای اولین باردرژنتیک سلولی پستانداران مطرح شد پیشنهاد کردند( Medgyesy et al, 1980). موادی مانند استات ید و یا استامیدید که بدین منظور و دراین روش استفاده می شود، پرتوتابی سیتوپلاسم والد بخشنده و عدم فعالیت متابولیکی هسته ای والدگیرنده را در هم ادغام می کند(روش بخشنده- گیرنده) ودرحال حاظر به طور معمول استفاده می شود. .

٢- امتزاج پروتوپلاست و نوترکیبی ژنومهای پلاست 

تفرق تصادفی تیپ های والدی درنسل های متوالی سلولی، فراوانترین الگوی رفتاری توده مخلوط پلاست ها دریک فرآورده امتزاج به شمار می رود. اینگونه موارد درگزارش های متعدد هیبریدهای رویشی(با هسته های هیبرید) وهیبریدهای سیتوپلاسمی(سیبریدها) به تأیید رسیده است. تحقیقات انجام شده حاکی از وقوع نوترکیب ژنوم پلاست درگیاهان عالی پس از دورگ گیری رویشی است (بین دو نیکوتیانا و بین نیکوتیانا و سولانوم ). در هر دو مورد، از جهش یافته های پلاست که مشخصه آنها مقاومت به آنتی بیوتیک یا توکسین و آلبینیسم می باشد استفاده شده است ( شکل١ ). کمیابی نوترکیبی پلاست مانع انجام هرگونه تخمین دقیق از فراوانی این نوترکیبی ها درسلول های هتروپلاست حاصل از الحاق می شود. معلوم شده است کلید این موفقیت ها که استفاده از فشارگزینشی شدید بود فقط زمانی امکان دارد که پلاست های جهش یافته به کارگرفته شوندتجزیه وتحلیل مولکولی ژنومهای پلاست به دست آمده درنوترکیب های نیکوتیانا آشکارکرده است که ازتعداد زیادی کراسینگ اور ناشی شده اند . 

٣- امتزاج پروتوپلاست و نوترکیبی ژنومهای میتوکندریایی

نرعقیمی سیتوپلاسمی که در طیف وسیعی ازگونه ها پیدا می شود تنها نشانگر ژنتیکی است که توسط ژنوم میتوکندری هدایت می شود. از این پدیده برای پیگیری سرنوشت ژنوم های میتوکندری در امتزاج پروتوپلاست استفاده می کنند. فقدان فشار گزینشی درسطح سلولی مانعی درسرراه بدست آوردن نوترکیبهای میتوکندریایی محسوب نمی شود. وقوع نوترکیبی معمولا ًبا یک فراوانی بالا رخ می دهد. مطالعات مولکولی قطعات محدود شده جدید میتوکندریایی درهیبریدهای رویشی یا سیبریدهای اطلسی و براسیکا تبادل DNA والدین را به خوبی به اثبات رسانده است. حاصل این کار، بدست آوردن ژنوم میتوکندریایی با ترتیبی جدید نوترکیبی جدید وترکیبی منحصر به فرد ازتوالی های والدی در هرسیبرید باززایی شده است. مطالعات امتزاج، گیاهان نرعقیم سیتوپلاسمی را نیز شامل می شود. فنوتیپ سیتوپلاسمی درخلال مرحله گلدهی مشخص می گردد. در نیکوتیانا، نرعقیمی ها بوسیله سیتوپلاسم گونه های مختلف القاء می شود. دراین ترکیبات آلوپلاسمی، پرچم ها به طورکلی حذف ویا اینکه به ساختارهای ماده آسا ویا گلبرگ مانند تغییرمی یابند. هرسیتوپلاسمی را می توان از طریق ظاهرخاص گل شناسایی کرد. جنبه جالب توجه نوترکیبی میتوکندریایی حاصل ازنیکوتیانای طبیعی و عقیم، پیدایش ظواهری جدید درگلی است که با هردو والد متفاوت است. این گونه نوترکیبات که دربین ژنوم های میتوکندریایی اکثرگونه هاپیدا شده امکان تبادل واقعی ژنهای میتوکندریایی را دربین گونه ها نوید می دهد.

٤- کاربرد امتزاج رویشی در دستکاری گونه های زراعی 

ژنوم های پلاستی که با یکدیگردریک سلول منفرد ادغام می شوند، بطور استثنایی نوترکیبی را طی و در نسل های بعدی سلولی تفرق پیدا می کنند. درمواقعی که یکی از والدین فاقد رقابت و یا از رقابت کمتری درمقایسه با دیگری برخوردار است این امرخیلی سریعتر به وقوع می پیوندد. بالعکس، ژنوم های میتوکندریایی غالباً نوترکیبی بین والدی و سپس تفرق را طی می کنند. اکثریت سیبریدها، ژنوم های میتوکندریایی نوترکیب همراه با ژنوم پلاست یکی از والدین را دارا هستند. 
 

شکل 1 – الگوی مورد استفاده برای انتخاب ژنوم های نوترکیب پلاست در توتون . نشانگرهای مختلف پلاستی که در این لاین های والدینی وجود دارند عبارتند از :

Chl^{- /} Chl⁺ = آلبینو/ طبیعی                                             Str^s/ Str^r  = حساسیت / مقاومت به استر پتومایسین

Ten^{s /} Ten^r = حساسیت / مقاومت به تنتوکسین           Lin^{s /} Lin^r= حساسیت / مقاومت به لینکومیسین

انتقال سیتوپلاسم های نرعقیم به ارقام مختلف :

امتزاج پروتوپلاست ابزاری برای انتقال تک مرحله ای یک سیتوپلاسم نرعقیم به واریته های مختلف بارور است. بدین ترتیب چرخه های متعدد تلاقی برگشتی مورد نیاز در روشهای معمول جنسی منتفی می گردد. در برنج گیاهان سیبریدحاوی هسته واریته بارور و میتوکندری های نوترکیب هردووالد، نرعقیمی والد نرعقیم را با خود حفظ کرده است. این موفقیت براساس روش بخشنده- گیرنده (Sidorov et al, 1981 ) صورت گرفته است. در هویج نیز برمبنای همین روش، نرعقیمی سیتوپلاسمی(بساک قهوه ای)به یک رقم بارور منتقل شده است. در براسیکا، به ارقام مختلف منداب روغنی، نرعقیمی سیتوپلاسمی انتقال یافته است. همچنین یک سیتوپلاسم سیبرید نرعقیم اصلاح شده را که قبلاً از طریق دورگ گیری رویشی به دست آمده بود به منداب روغنی زمستانه انتقال داده اند. در چغندرقند، باززایی گیاه کامل از پروتوپلاستها، امکانات انتقال سیتوپلاسم از منابع مختلف نرعقیم سیتوپلاسمی را به زمینه های مختلف هسته ای فراهم ساخته است. این روش درگونه مذکور از اهمیت خاصی برخوردار است زیرا چغندرقند دو ساله بوده و تولید هیبرید درجهان صرفاً برمبنای نرعقیمی اون (Owen CMS source) (١٩٤٥) است به طوری که این محصول به طور بالقوه دربرابر نژادهای جدید پاتوژن ها آسیب پذیر می گردد. درتوتون برمبنای ادغام پروپلاست نیکوتیاناتاباکوم با نیکوتیاناآفریکانا (حاوی پروپلاست پرتو دیده) تیپ جدیدی از نرعقیمی سیتوپلاسمی خلق شده است. ترکیب مذکور به خصوص درموقعی که گونه دوم به عنوان والد مادری در نظر گرفته می شود به طور جنسی ناسازگار است.                    

اصلاح سیستم های نرعقیمی سیتوپلاسمی در چلیپاییان :

  دارند.( B.napus,…) و روغن ( B. oleracea ,…) محصولات براسیکا اهمیت اقتصادی مهمی ازنظر سبزی برای مصارف انسان وصنعت پس ازسویا و نخل سومین منبع مهم روغن به شمار می روند. با اینکه واریته های هیبرید دراین گونه ها بر مبنای سیستم های خود ناسازگاری تولید شده ولی هرگز در مقیاسی بزرگ نبوده و از نظرکنترل گرده افشانی از طریق نرعقیمی نیازی جدی احساس می شد. نرعقیمی سیتوپلاسمی پیدا شده در تربچه به براسیکا اولراسیا و براسیکا ناپوس ازطریق تلاقی بین گونه ای معرفی گردید ولی گیاهان حاصله ضمن اینکه به طورکامل نرعقیم بودند به خاطر نقص کلروفیلی دردماهای پایین وناهنجاری های گل(تولید ناقص شهدوکاهش باروری ماده) عملاً قابل استفاده نبودند. دربررسی پلتیروهمکاران به منظور تبادل کلروپلاست های تربچه با کلروپلاستهای براسیکاونیل به سنتزطبیعی کلروفیل، امتزاج رویشی بین پروپلاست های براسیکای حاوی اندامک های تربچه و پروتوپلاست های دارای اندامک های براسیکا صورت گرفت و از بین گیاهان باززایی شده گیاهان سبزطبیعی و نرعقیم جدا شدند(Pelletier et al, 1983 ). آنها نشان دادندکه حاوی ژنوم های نوترکیب میتوکندریایی هستند. دربین این سیبریدها، بعضی توسط متخصصین انتخاب شدند، زیرا در آزمایشهای مزرعه با نتاجشان ثابت کردندکه سایر نقایص مربوط به مرفولوژی گل درآنها رفع شده است. تولید شهد دراین گیاه آنقدرکافی بود که همانند گیاه بارور زنبورها را جلب وتشکیل بذرطبیعی گشت. این ویژگیها با وقایع نوترکیبی بین ژنوم های میتوکندریایی دووالد همبستگی داشت. براساس نتایج بدست آمده از سیبریدهای براسیکا این نکته به اثبات رسیدکه ازجنبه اصلاحی فقط بایستی بخش کوچکی ازژنوم بیگانه به درون گونه زراعی وارد شود. زمانی که یک ژنوم صفت مطلوبی مانند نرعقیمی سیتوپلاسمی را با خود دارد و ژنوم کامل اندامک منتقل می گردد. به خاطراثرمتقابل بقیه ژنها با هسته گونه زراعی، معایب زراعی احتمال ظهورشان بالاست. این نتایج اهمیت عملی نوترکیبی میتوکندریایی که مجال حذف این صفات نامطلوب را فراهم می کند به اثبات می رساند. ازاین سیتوپلاسم ها درحال حاضرتوسط متخصصین اصلاح نباتات استفاده می شود.

هیبریداسیون سلول سوماتیکی :                                               

هیبریداسیون سلول سوماتیکی که لقاح سلول سوماتیکی یا لقاح پروتوپلاست نامیده می شود دلالت براتحاد پروتوپلاست گیاهی سلولهای سوماتیک گونه های مختلف ومتعاقباً باززایی گیاهان هیبریدحاصل از پروتوپلاست های لقاح شده دارد. این روش برای استفاده در بهنژادی گیاهی برای ایجاد هیبرید با اتحاد سلولهای سوماتیک که درآن گیاه به طریقه دورگ گیری جنسی تلاقی های بین گونه ای تهیه بذرامکان پذیر نباشد، توصیه شده است. هیبریداسیون سلول سوماتیکی فرآیندی چند مرحله ای شامل ایزوله نمودن پروتوپلاست های گونه های مختلف، اتحاد پروتوپلاست های دو گونه مختلف، شناسایی نمودن پروتوپلاست های لقاح یافته هیبریدو باززایی گیاهان هیبرید دور ازپروتوپلاست های لقاح شده می شود. قبل ازاتحاد سلول های گیاهی، حذف دیواره سلولی جهت تولید پروتوپلاست های بدون دیواره ضروری است. سلول های مزوفیل برگ یا سایربافتهای گیاهی، کالوس یاکشت های سوسپانسون سلولی باآنزیمهای هضم کننده دیواره سلولی برای بدست آوردن سوسپانسیون پروتوپلاست ها، تیمار می گردند. برای دورگ نمودن پروتوپلاستهای خالص گونه ها آنها را مخلوط نموده وبه همراه یک عامل آمیخته کننده غالباً پلی اتیلن گلایکول سانتریفوژ می نمایند. تا آنجا مخلوطی ازپروتوپلاست های والدی، پروتوپلاست های آمیخته شده والدی و پروتوپلاست های آمیخته شده هیبریدبوجود می آید. پروتوپلاست های هیبرید به سلول های دارای دیواره و ادامه تقسیم سلولی وادار شده و درنهایت گیاهچه های دارای ریشه و ساقه تولید می گردند. هیبریداسیون سلول سوماتیکی هنگامی به عنوان روشی برای اصلاح کننده نبات درمی آید که تکنیک های متداولی برای کشت پروتوپلاست گونه والدین ایجادگردد. باززایی گیاه از پروتوپلاست های بعضی ازگونه ها مثل سیب زمینی، توتون، یونجه وتعداد اندکی ازگونه های دیگربه راحتی امکان پذیر است درحالی که درغلات وحبوبات به سختی قابل اجرا می باشد. سلول های بین گونه های خویشاوند دور اغلب آنیوپلوئید بوده و به ندرت باززایی شده ودرصورت باززایی شدن گیاهانی عقیم بدست می آید.

روشهای القاء امتزاج :

۱- امتزاج خودبخودی

همانطور که از اسم این روش بر می آید روشی است که در آن امتزاج پروتوپلاستی بدون دخالت دادن هر نوع ماده امتزاج دهنده یا استفاده از محرک صورت می گیرد. امتزاج خودبخودی برای اولین بار درسال ١٩٠٢ توسط کاسترتشریح شد. عیب عمده این روش این است که امتزاج به ندرت اتفاق می افتد. به کاربردن امتزاج خود بخودی تولید پروتوپلاست های چند هسته ای درسویا را که هسته های آنها بطور هم زمان تقسیم می شوند امکان پذیر ساخته است. فراوانی اندک امتزاج با این روش مانع از توسعه آن گردیده و لذا تاکید بیشتر برروش های آزمایشی امتزاج که ذیلاً تشریح می شود صورت می گیرد.

2 - روش القاء امتزاج با پلی اتیلن گلیکول (PEG)  

روش استفاده از پلی اتیلن گلیکول به عنوان یک ماده القاء کننده امتزاج، برای اولین بار توسط کائو در میکالوگ و والین و همکاران (1974) تشریح شده است. PEG یک پلیمرآلی است که با وزنهای مولکولی متفاوت قابل دسترس می باشد. موثرترین دامنه ۱٥٤٠ PEG ، ٤٠٠٠ PEG و٦٠٠٠ PEG می باشد. برای القاء امتزاج با PEG آن را به محیط کشت اضافه می نمایند و دراین ماده مخلوط پروتوپلاست های قابل امتزاج را به حالت سوسپانسیون درمی آورند. معمولاً ازPEG ٣3 – ٢٥% (حجمی/ وزنی) استفاده می شود. باید دقت کرد از مقدار درست و اندازه مولکولی صحیح PEG استفاده کرد. اضافه کردن مقدار زیادی از این ماده باعث انعقاد توده های پروتوپلاست می گردد و اضافه کردن مقدارخیلی کم آن موجب چسبیدن پروتوپلاستها به جای امتزاج می شود. کار با PEG بایستی به دقت مورد ارزیابی قرارگیرد، زیرا این ماده درسلول ها باعث مسمومیت می گردد. بطورمعمول، مخلوط پروتوپلاست را با PEG به مدت ١٠ تا ٣٠ دقیقه درانکوباتورقرار می دهند. بعد از این مدت PEG را می شویند تا از مخلوط حذف گردد. اکثر امتزاج ها درمرحله شستشو صورت می گیرد. بکار بردن PEG به عنوان یک ماده القاء کننده امتزاج امروزه بطور وسیع مورد استفاده قرار می گیرد.

٣ – روش استفاده از کلسیم و PH بالا

این روش شامل قراردادن مخلوط پروتوپلاست در٠٥/٠ مول کلرورکلسیم با PH برابر٥/١٠ در٤/٠ مول مانیتول درون انکوباتور می باشد( Keller and Melchers,1973). پروتوپلاستها را بعدازآن به مدت٣ دقیقه در سرعت پایین سانتریفوژ(g×٥٠) دردرون مخلوط قرارمی دهند. کلروملچرموفقیت درامتزاج ٢٥% پروتوپلاستها راگزارش کرده اند. این روش برای امتزاج پروتوپلاست های مزوفیل برگ وپروتوپلاست های بدست آمده از سلولهای کشت شده مورد استفاده قرارگرفت. پروتوپلاست های امتزاج یافته با مشاهدات چشمی قابل تشخیص هستند .            

٤- استفاده از نیتریت سدیم

اضافه کردن نیتریت سدیم به مخلوط پروتوپلاست ها به امتزاج آنها کمک می کند. استفاده از این روش توسط پاورو همکاران(1970) درموقع امتزاج درون گونه ای و بین گونه ای درپروتوپلاست های یولاف و ذرت توسعه یافت. نیتریت سدیم امتزاج بین پروتوپلاست های با سیتوپلاسم زیاد، پروتوپلاست های با واکوئل کم و پروتوپلاست های ریشه را القاء می کند. به طوری که هرچه پروتوپلاست ها متمایزترباشند به همان میزان القاء امتزاج آسان ترخواهد شد .                                                             

٥- روشهای مصون سازی

هارتمن و همکاران(1973) روش مصون سازی القاء امتزاج پروتوپلاست را تشریح کردند. آنها پادتنی را با تزریق عصاره های گیاهی به بدن خرگوش تولید کردند. خرگوش دامنه وسیعی از آنتی بادی را برضد پروتئین های مختلف گیاهی تولید کرد. سپس اثر این پادتن را در امتزاج پروتوپلاست های به دست آمده از Bromus ، سویا و باقلا مورد مطالعه قراردادند این پادتن پس ازامتزاج پروتوپلاست ها باعث اخته شدن گردید. پروتوپلاست های امتزاج یافته قوه نامیه خود را حفظ کرده وحتی تقسیمات سلولی هم درآنها مشاهده گردید .                             

٦- امتزاج مکانیکی

میشل و اسچریک(1971) ازروش های فیزیکی نظیر فشارهای مکانیکی القاء امتزاج پروتوپلاست استفاده می کردند. این روش ها به لحاظ راندمان کم آنها درتولید دورگ ها کمتر مورد توجه قرار گرفتند. ولی یکی از محاسن این روش این است که هیچ ماده شیمیایی که ممکن است عوارض جانبی داشته باشد، مثل ایجاد موتاسیون در سلول های کشت شده، دراین جا به کار نمی رود .

٧- امتزاج الکتریکی

اگر پروتوپلاست را در یک محیط کشت سلولی حاوی الکترود قراردهند و به آنها انرژی های پتانسیل مختلف وارد نمایند پروتوپلاست ها بین دوالکترود در یک خط قرار می گیرند(man,1982Zimmer). اگرشخص در این موقع شوک های الکتریکی با موج های مربعی کوتاه وارد نماید می تواند القاء پروتوپلاست را فراهم سازند. این روش به خاطرقابلیت کنترل بالای ذاتی از معروفیت زیادی برخوردار است. درحقیقت امتزاج دو پروتوپلاست با این روش امکان پذیر است.        

٨- روشهای دیگر

کامیا (Kameya) استفاده از ژلاتین با غلظت ٢ تا ٥ درصد را به عنوان یک ماده امتزاج دهنده گزارش نموده است. او همچنین نشان داده است که(PotassiumDextranSulphate ) ماده امتزاج دهنده خوبی است. از مواد شیمیایی دیگر که به عنوان مواد امتزاج دهنده با درجات مختلف استفاده شده است. کانکانوالین آ (AConcanvalin) پلی- ال- ارنیتین، سیتوچلازین بی، پلی- ال- لایزین، گلیسرول و دی متیل سولفوکسید را می توان نام برد. ظاهراً روش های مختلف و زیادی برای القاء پروتوپلاست موجود است. در اکثریت این روشها، دو نوع پروتوپلاست با منشأ مختلف درحضور ماده امتزاج دهنده با هم مخلوط می کنند و اجازه می دهند آنها به طورتصادفی با هم امتزاج یابند. مشکل این روش این است که پروتوپلاست نه تنها با سلولهای هم نوع خود امتزاج می یابد بلکه با انواع دیگر هم می تواند ترکیب شود. روش هایی جهت شناسایی امتزاج های مطلوب که بطور طبیعی از امتزاج پروتوپلاست های نوع A با پروتوپلاست های نوع B حاصل می شود وجود دارد. در زیر به چندروش که برای سلکسیون دورگ های سماتیکی استفاده شده است اشاره می کنیم .

الف - سلکسیون مشاهده ای : از این روش برای سلکسیون گیاهان حاصل از پروتوپلاست هایی که دارای

صفات فیزیکی مشخصی هستند استفاده می شود. نتیجه این امتزاج تولید دورگی است که دارای واکوئل های حاوی کلروپلاست و آنتوسیانین با دو هسته می باشد. همچنین این روش می تواند برای امتزاج پروتوپلاست های بدست آمده از مزوفیل برگ و پروتوپلاست های سلول های کشت شده فاقد کلروفیل نیز مورد استفاده قرار گیرند. تکنیک ارزیابی مشاهده ای گاهی با روش کشت قطرات ریز(Microdrop ) با هم به کار برده می شود. این قطرات ریز به طریق میکروسکوپی مورد آزمایش قرار گرفته است، آن قطراتی که درآنها امتزاج انجام شده است نشان دار می کنند تا نمود بعدی آن را دنبال کنند. عیب عمده این روش آن است که خیلی پر زحمت بوده و تعداد محدودی از محصول امتزاج یافته را می توان سلکسیون کرد .

ب - نشان های فلورسانس: استفاده ازروش های رنگی فلورسنت برای اولین بارتوسط کلر(1977) برای مطالعه امتزاج درسلولهای گیاهی تشریح گردید. بعدها ازاین روش برای امتزاج پروتوپلاست های گیاهی جدا شده قابل استفاده شد. این روش بر این پایه برنامه ریزی شده است که اگر از دو پروتوپلاست اصلی کشت شده یکی را در sceininofluorece Octadecony و دیگری را درOctadecy Palamine B به مدت١٢ تا١٥ ساعت درون انکوباتور قرار دهند، هرگروه از این پروتوپلاست ها توسط یک رنگ ویژه فلورسانس رنگ آمیزی خواهند شد. این مواد رنگی برای پروتوپلاست ها ایجاد مسمومیت نکرده وصدمه ای به قوه نامیه، بازآفرینی دیواره ورشدشان وارد نمی سازند. پس از ایجاد امتزاج وتولید محصول امتزاج یافته، شناسایی این دورگ ها با مشخصات فلورسانس مربوطه زیر میکروسکوپ فلورسانس امکان پذیر خواهد بود و با استفاده از یک میکرومانیپولاتور عمل جدا کردن و کشت دورگ ها انجام می گیرد. جداسازی محصول امتزاج یافته نشان دار شده با میکرومانیپولار هنوز یک روش وقت گیر بوده و نیاز به مهارت دارد .                                       

ج – استفاده از دستگاه سورت کننده سلولی فعال شده با فلورسانس: پروتوپلاست را با فلورسانس نشان دار می کنند که در بخش( ب) بیان گردید. پس از امتزاج٣ نوع فلورسانس می توان مشاهده کرد : دونوع ازآنها فلورسانس های اصلی از جمعیت والدین می باشند و نوع سوم فلورسانس دورگ های حاصل از امتزاج است. این روش هنوز در مرحله آزمایشی است ولی با این روش می توان هزاران محصول امتزاج را جدا نمود. عیب عمده این تکنیک ظاهرفریبی و هزینه آن می باشد .

چ- سلکسیون با توجه به مواد غذایی: در حالت های ویژه، کارلسون و همکاران توانستند محصول دورگ ( امتزاج یافته) را با امکان کشت آنها درروی ماده غذایی که درآن امکان رشد برای لاینهای والدین  پروتوپلاست وجود ندارد جدا نمایند. کارلسون توانست پروتوپلاست های والدین و محصول امتزاج یافته را در محیط کشت فاقد اکسین کشت نماید. در این محیط دو لاین سلولی مربوط به والدین به خاطر فقدان اکسین در محیط کشت نتوانستند رشد کنند. ولی سلولهای دورگ تولید کننده اکسین توانستند رشد کرده و به کالوس تبدیل شوند. کارلسون توانست این گیاهان دورگه سوماتیکی را با گیاهان تولید شده با تلاقی جنسی متداول مقایسه نماید . 

ح- حساسیت به نور: ملچرو لبیب (1974 )یک روش برای سلکسیون دورگ ها بر اساس مکمل ژنتیکی

تشریح نمودند. آنها دو موتانت توتون را یکی با کلروفیل ناقص و دیگری حساس به نور را از توتون (Tobacum N.) در آزمایشهای خود بدست آوردند. وقتی پروتوپلاست های این دو گیاه را با هم امتزاج دادند. نتیجه دستیابی به یک گیاه سبز نرمال بود. به این جهت در موقع بازآفزینی گیاهچه از مخروط پروتوپلاست دو کلون والدین به نور حساس بودند. ولی گیاهچه دورگ یک گیاه سبز نرمال بود. این یک روش دقیق برای سلکسیون دورگ های سوماتیکی است. نیاز برای تولید تعداد بی شماری موتاسیون های قابل سلکسیون یعنی گیاهچه حساس به نور و دارای کلروفیل ناقص برای این نوع مطالعات زیاد است .                          

د- حساسیت به دارو و مقاومت: پاور و همکاران (1976) از حساسیت گیاهان بر اکتینومایسین دی برای سلکسیون محصولات امتزاج حاصل از اطلسی hybrida petunia, P. Parodii استفاده کردند. دو گیاه والدینی به اکتینومایسین- دی حساس ولی گیاه دورگ مقاوم به آن می باشد. پاور توانست دورگ های سوماتیکی را درحضور اکتینومایسین– دی درماده غذایی باز آفرینی نماید. بعضی از محققین حالا به دنبال تولید موتانت های بسیار مقاوم هستندتا درمطالعات امتزاج پروتوپلاست از آنها استفاده شود .

چه گیاهانی را باید دورگ گیری کرد ؟

در اوایل سال ١٩٦٠بیولوژیست های گیاهی می خواستند بین علم و افسانه علمی تلاقی انجام دهند و امتزاج پروتوپلاست تا حدودی مطرح شد که بیشترخیالی بود. به عنوان مثال می خواستند بین هویج وکلم پیچ دورگ گیری انجام دهند به طوری که درقسمت هوایی تولید کلم و در زیر خاک ریشه هویج به دست آورند. نظیر آرزوی بشردر تولید پومیتو(Pomato) (درقسمت هوایی گوجه فرنگی و درقسمت زیرزمین سیب زمینی) دورگ گیری به عنوان یک سیستم مدل برای مطالعه گوجه فرنگی و سیب زمینی موفق بود گرچه این روش دورگ های سماتیکی را تولید کرده و برای مطالعات پایه مفید است ولی تا به حال گیاه زراعی با ارزش از این روش به دست نیامده است. اخیراً امتزاج پروتوپلاست سیب زمینی های دارای ناسازگار جنسی tuberosum S.   ,brevidens.S انجام شده است. دورگ های ایجاد شده با روش امتزاج سماتیکی بارور بود و حاوی ژنهای مهم مقاومت والد brevidens.S مثلاً مقاومت به ویروس پیچیدگی برگ (PLRV) می باشد. این روش با این که قابل استفاده است ولی از آن نمی توان مستقیماً برای تولید گیاهان زراعی مفید بهره برداری کرد اما یک وسیله خوب برای وارد کردن ژن ها به داخل برنامه های بهنژادی سنتی است.

تشکیل سایبرید (dCybri):

وقتی دو پروتوپلاست با هم امتزاج می یابند حالات مختلفی ممکن است حاصل شود اگردو هسته با هم امتزاج یابند یک دورگ حقیقی تشکیل می شود. ولی اغلب دو هسته به طور مستقل از هم در سیتوپلاسم مخلوط به دست می آیندو تشکیل هتروکاریون را می دهند. تلفات کروموزومی می تواند در یک یا هردو هسته ایجاد شود. اگر تمام هسته یکی از والدین از بین برود تنها یک هسته در مخلوط دو سیتوپلاسم باقی می ماند که این دورگ را سیتوپلاست یا سایبرید می گویند. سایبریدها را همچنین می توان با امتزاج یک پروتوپلاست طبیعی(نرمال) با یک پروتوپلاست بدون هسته( enucleated ) تولید کرد. پروتوپلاست بدون هسته را با پرتوتابی یا حذف فیزیکی هسته می توان به دست آورد. درتولید طبیعی دورگ ازراه تکثیر جنسی دوگامت با هم امتزاج یافته وتولید جنین زیگوت می نمایند. دراین فرآیند سیتوپلاسم والد به طور طبیعی خارج شده و تنها صفات سیتوپلاسمی والد مادری باقی می ماند. بنابراین تولید سایبرید یک روش مفید برای انتقال اطلاعات توارثی سیتوپلاسمی می باشد. در حال حاضر محققین در مورد استفاده از سایبرید ها برای انتقال قدرت مقاومت در برابر بعضی علف کشها مطالعه می کنند. این صفت مقاومت درروی ژنوم کلروپلاست حمل می شود. انتقال نرعقیمی سیتوپلاسمی می تواند با انتقال ژنوم میتوکندری کنترل شود. مطالعه در روی سایبرید ها همچنین برای تحقیق در امکان نوترکیبی در ژنوم های برون کروموزومی از اهمیت زیادی برخوردار است.

چشم اندازهای تکنولوژی پروتوپلاست :

پیشرفتهای قابل توجهی در دو دهه اخیردرتکنولوژی پروتوپلاست (جدا کردن، امتزاج، کشت وباززایی گیاه) درمحصولات مهم زراعی از جمله غلات پدیدار شده است. امتزاج رویشی از طریق تولید هیبریدهای هسته ای نامتقارن بین گونه های دور مجال فائق آمدن بر موانع تبادلات درتکثیر جنسی را فراهم کرده است. در مواردی که پلی پلوئیدی و یا فقدان اندام های جنسی بارور (محصولاتی که از طریق رویشی تکثیر می شوند) مانعی بر سرراه تبادلات ژنی است این تکنیک امکانات زیادی را دراختیار قرار می دهد. بعلاوه امتزاج پروتوپلاست ابزار غیرقابل جایگزینی است که موجبات دستکاری ژنوم اندامک ها را فراهم می کند و خلق ترکیبات جدیدی از هسته و سیتوپلاسم را ممکن می سازد.