Biotechnology

بررسي پيوند پپتيدي:

در اواخر دهه 1930، لينوس پائولينگ و رابرت كوري با استفاده از روش كريستالوگرافي اشعه X ، ساختار دقيق آمينواسيدها و پپتيدها را مورد بررسي قرار دادند. هدف آنها از اين مطالعات، تعيين فاصله پيوند بين اتمها و زواياي پيوند بود تا با استفاده از اين اطلاعات بتوانند كونفورماسيون ( آرايش فضايي گروههاي متصل به يك اتم  مي توانند حول يك پيوند بچرخند) پروتئين ها را پيشگويي كنند.

يكي از يافته هاي ارزشمند اين دو محقق آن بود كه واحد پپتيدي محكم و مسطح است. هيدروژن گروه آميني در اين پيوند هميشه در موقعيت Trans نسبت به اكسيژن گروه كربونيل قرار مي گيرد. پيوند ميان اتم كربن گروه كربونيل و اتم نيتروژن داراي آزادي چرخش نيست و تقريباً مانند يك پيوند دوگانه عمل مي كند. طول اين پيوند، كوتاه و در حدود 32/1 آنگستروم بوده و ميانگين طول پيوند ساده C-N ( 49/1 آنگستروم) و پيوند دوگانه C=N ( 27/1 آنگستروم) است و به همين دليل، خصوصيات يك پيوند دوگانه نسبي را نشان مي دهد. پيوند ميان كربن α و كربن گروه كربونيل از نوع پيوند ساده بوده و طول آن 51/1 آنگستروم است. همچنين پيوند بين كربن α در اسيد آمينه دوم و نيتروژن نيز از نوع پيوند ساده ( 46/1 آنگستروم) است. بنابراين درجه آزادي چرخش حول اين پيوندها زياد بوده و اتمهايي كه در پيوند پپتيدي درگير شده اند، روي يك خط قرار نمي گيرند ولي در يك صفحه هستند.

توالي اسيدهاي آمينه ساختمان اوليه پپتيدها را مشخص مي كند :

براي تعيين ساختمان اوليه يك پلي پپتيد بايد تعداد، ساختمان و ترتيب همه ريشه هاي اسيدهاي آمينه را مشخص كرد.

جايگزيني تنها يك اسيد آمينه بجاي اسيد آمينه ديگر در توالي خطي بيش از 100 اسيد آمينه مي تواند منجر به كاهش يا از بين رفتن فعاليت بيولوژيك شده، عواقب بالقوه و وخيمي به جاي گذارد، مانند بيماري كم خوني سلول داسي شكل.

براي ناميدن اسيدهاي آمينه موجود در پپتيدها از علائم اختصاري استفاده مي شود :

براي نمايش ساختمان اوليه پپتيدها مي توان از دو نوع علامت اختصاري سه حرفي و يك حرفي اسيدهاي آمينه استفاده كرد. استفاده از حرفي كه با خطوط مستقيم بهم وصل شده اند، روش شناخته شده و صريح براي نمايش ساختمان اوليه پپتيدها است. در صورت استفاده از علايم اختصاري يك حرفي اين خطها حذف مي شوند. در صورتي كه ترتيب دقيق بخشي از ساختمان پلي پپتيد مشخص نباشد، ريشه هاي مشكوك و مورد نظر درون كروشه قرار گرفته و با علامت كاما از هم جدا مي شوند.

پپتيدهاي موجود در سيستم هاي بيولوژيك، از نظر اندازه متفاوتند و ممكن است بصورت انواع كوچك با دو يا سه اسيد آمينه تا انواع بسيار بزرگ متشكل از هزاران اسيد آمينه ديده شوند.

دو مولكول اسيد آمينه مي توانند بطور كووالان از طريق يك پيوند آميدي يا پيوند پپتيدي به يكديگر متصل شده و ايجاد يك دي پپتيد كنند. اين پيوند با برداشت عناصر يك مولكول آب ( دهيدراتاسيون ) از گروه α-كربوكسيل يك اسيد آمينه و α-آمينوي اسيد آمينه ديگر ايجاد مي گردد.

گروه α-آمينوي يك اسيد آمينه به عنوان يك نوكلئوفيل عمل نموده تا جايگزين گروه هيدروكسيل اسيد آمينه ديگر شده و ايجاد يك پيوند پپتيدي ( تيره ) كند.

 تشكيل پيوند پپتيدي مثالي از يك واكنش كندانساسيون است كه يكي از كلاس هاي معمول واكنش ها در سلولهاي زنده مي باشد. تحت شرايط بيوشيميايي استاندارد، تعادل واكنش بالا بيشتر به سمت مواد شركت كننده در واكنش است تا محصول دي پپتيدي. براي اينكه اين واكنش از نظر ترموديناميكي قابل انجام باشد، لازم است گروه كربوكسيل دچار تعيير شيميايي شده و يا به طريقي فعال گردد كه گروه هيدروكسيل آن راحت تر برداشت شود.

سه اسيد آمينه مي توانند توسط دو پيوند پپتيدي به يكديگر متصل شده و ايجاد يك تري پپتيدكنند؛ بطور مشابه اسيدهاي آمينه با اتصال به يكديگر توليد تترا پپتيد، پنتاپپتيد و غيره مي كنند. وقتي تعداد كمي از اسيدهاي آمينه به اين طريق به يكديگر اتصال مي يابند، ساختمان حاصل را اوليگوپپتيد گويند. وقتي تعداد اين اسيدهاي آمينه زياد باشد، محصول را پلي پپتيد مي نامند. در ساختمان پروتئين ها ممكن است هزاران اسيد آمينه وجود داشته باشد. هر چند گاهي اصطلاحات پروتئين و پلي پپتيد بجاي يكديگر بكار مي روند، مولكولهايي كه به آنها پلي پپتيد اطلاق مي گردد، عموماً داراي وزن مولكولي كمتر از 10000 هستند.

شكل صفحه بعد ساختمان يك پنتاپپتيد را نشان مي دهد. اسيد آمينه موجود در يك پپتيد را اغلب يك ريشه ( قسمت باقيمانده بعد از جدا شدن يك اتم هيدروژن از گروه آمينو و يك عامل هيدروكسيل از گروه كربوكسيل آن )‌گويند. در يك پپتيد، ريشه اسيد آمينه موجود در انتهاي داراي گروه α-آمينو آزاد را ريشه انتهاي آمينو ( يا انتهاي N ) و ريشه موجود در انتهاي ديگر داراي يك گروه كربوكسيل آزاد را ريشه انتهاي كربوكسيل ( يا انتهاي C ) گويند.

هرچند هيدروليز يك پيوند پپتيدي يك واكنش انرژي زا است، بخاطر انرژي فعالسازي بالاي آن، به آهستگي صورت مي گيرد. لذا پيوندهاي پپتيدي موجود در پروتئين كاملاً پايدارند و تحت اكثر شرايط داخل سلول، نيمه عمري حدود 7 سال دارند.

ساختمان اوليه بر فعاليت فيزيولوژيك پپتيد تاثير دارد

جايگزيني تنها يك اسيد آمينه بجاي اسيد آمينه ديگر در توالي خطي بيش از 100 اسيد آمينه منجر به كاهش يا از بين رفتن فعاليت بيولوژيك شده، عواقب بالقوه و وخيمي به جاي گذارد ( مانند بيماري كمخوني سلول داسي شكل ). در بسياري از اختلالات متابوليك ارثي تنها يك تغيير منفرد از اين نوع وجود دارد.

بسياري از پپتيدها فعاليت فيزيولوژيك دارند

در سلول هاي جانوران، گياهان و باكتري ها پلي پپتيدهاي مختلفي با وزن مولكولي پايين وجود دارد ( 3 تا 100 ريشه اسيد آمينه ) كه فعاليت فيزيولوژيكي بارزي بر عهده دارند.

در مولكلول گلوتاتيون، گلوتامات انتهايي N از طريق يك پيوند غير آلفا پپتيدي به سيستئين متصل شده است. اين مولكول مورد نياز آنزيم هاي متفاوتي است. گلوتاتيون و آنزيم گلوتاتيون ردوكتاز در تشكيل پيوندهاي دي سولفيدي صحيح در بسياري از پروتئين ها و هورمونهاي پلي پپتيدي شركت داشته و در متابوليسم گزنوبيوتيكها ( Xenobiotics ) نقش دارند.

آنتي بيوتيكهاي پلي پپتيدي كه توسط قارچ ها ساخته و آزاد مي شوند داراي هر دو نوع اسيد آمينه D و L و اسيدهاي آمينه اي كه در پروتئين ها وجود ندارند مي باشد. از جمله اين آنتي بيوتيكها مي توان به تيروسيدن، گراميسيدين اشاره كرد. اين پلي پپتيدهاي حلقوي داراي D فنيل آلانين و اسيد آمينه غير پروتئيني اورنيتين مي باشند.

پپتيدها پلي الكتروليت هستند

در هيچ مقدار pH موجود در شرايط فيزيولوژيك، پيوند پپتيدي ( آميدي ) باردار نيست. بنابراين تشكيل پپتيدها از اسيد آمينه در pH برابر 4/7 با از بين رفتن خالص يك بار الكتريكي مثبت و يك بار منفي به ازاي هر پيوند پپتيدي تشكيل شده، همراه مي باشد. به علت وجود گروههاي دو انتهاي C و N و گروههاي R اسيدي يا بازي، پپتيدها در pH فيزيولوژيك مولكولهايي داراي بار الكتريكي هستند.

پيوند پپتيدي بطور نسبي ماهيت پيوند دوگانه را دارد

هر چند براي نوشتن ساختمان پپتيدها اتمهاي آلفا- نيتروژن و آلفا-كربوكسيل توسط يك پيوند منفرد به هم متصل مي شوند، اين پيوند در حقيقت ماهيت يك پيوند دوگانه نسبي يا ناقص را دارد.

اتمهاي اطراف پيوندي كه اتمهاي C و N را بهم وصل مي كند آزادي چرخش ندارد. در نتيجه هر چهار اتمي كه در شكل زير نشان داده شده در يك صفحه قرار داشته يا Coplanar مي باشند. اين حالت نيمه سختي اتمها ماهيت زيادي در ساختمانهاي ديگر پروتئين در مراتب بالاتر از ساختمان اوليه دارد. بر عكس حالت فوق، اتمهاي اطراف بقيه پيوندهاي موجود در اسكلت پلي پپتيدي آزادي چرخش فراواني دارند.

ابعاد يك زنجيره پلي پپتيدي كاملاً گسترده شده. چهار اتمي كه در نواحي سايه دار مشخص شده اند در يك صفحه قرار داشته و پيوند

پلي پپتيدي را تشكيل مي دهند. اتم هايي كه در نواحي تيره قرار ندارند عبارتند از: اتم كربن آلفا، اتم هيدروژن آلفا و گروه R آلفاي هر

اسيد آمينه خاص.

نيروهاي غير كووالان بر شكل پپتيدها تاثير مي گذارند

با اينكه يك پلي پپتيد ممكن است آرايش فضايي متفاوتي داشته باشد، در يك محلول اشكال معدودي بصورت غالب وجود دارد. وجود اين اشكال خاص نشانه دخالت عواملي مانند موانع فضايي، تداخلات نيروهاي كلوني، پيوند هيدروژني و تداخلات هيدروفوبي مي باشد.

پپتيدها را مي توان بر اساس خاصيت يونيزاسيون آنها تشخيص داد

پپتيدها تنها داراي يك گروه α-آمينو آزاد و يك α-كربوكسيل آزاد هستند كه هر كدام از آنها در يك انتها قرار دارند. اين گروهها همانند حالت موجود در اسيدهاي آمينه آزاد، يونيزه هستند ولي بخاطر عدم وجود گروههاي با بار مخالف بر روي كربن α، ثابت هاي يونيزاسيون آنها متفاوت مي باشد. گروههاي α-آمينو و α-كربوكسيل تمامي اسيدهاي آمينه غير انتهايي در ايجاد پيوندهاي كووالان پپتيدي شركت مي كنند؛ لذا يونيزه نيستند و نقشي در رفتار اسيد- بازي كلي پپتيدها ندارند. هر چند، گروههاي R برخي اسيدهاي آمينه موجود در يك پپتيد، قابليت يونيزاسيون را دارد و اين گروهها در خصوصيت اسيد- بازي كلي مولكول همكاري مي كنند. بنابراين، رفتار اسيد- بازي يك پپتيد را مي توان از روي گروههاي آزاد α-آمينو و α- كربوكسيل و همچنين ماهيت و تعداد گروههاي R قابل يونيزاسيون موجود در آن پيش بيني نمود.

همانند اسيدهاي آمينه پپتيدها داراي منحني هاي مشخص تيتراسيون و يك pH ايزوالكتريك ( pI ) خاص مي باشند كه در آن pH حركتي در ميدان الكتريكي ندارند. از اين ويژگي در برخي از تكنيك ها براي جداسازي پپتيدها و پروتئين ها استفاده مي گردد. وقتي يك اسيد آمينه در ساختمان يك پپتيد قرار مي گيرد، مقدار  گروه R قابل يونيزاسيون آن مقداري تغيير مي نمايد. از دست رفتن بار گروههاي α- آمينو و α- كربوكسيل، تعامل با ساير گروههاي R پپتيدي و عوامل محيطي ديگر مي توانند بر روي   اثر بگذارند.

پپتيدها و پلي پپتيدها داراي فعاليت بيولوژيك، از نظر اندازه بسيار متفاوت هستند

در مورد ارتباط وزن هاي مولكولي پپتيدها و پروتئين هاي داراي فعاليت با عملكرد آنها، هيچ قاعده ي كلي وجود ندارد. اندازه پپتيدهاي طبيعي ممكن است از دو تا هزاران اسيد آمينه متفاوت باشد. حتي كوچكترين پپتيدها نيز اعمال بيولوژيكي مهم را انجام مي دهند. دي پپتيد L- آسپارتيل- L- فنيل آلانين متيل استر، بعنوان يك شيرين كننده مصنوعي است كه بطور تجارتي سنتز شده و بنام آسپارتام يا نوتراسوئيت مشهور مي باشد.

بسياري از پپتيدها اثرات خود را در غلظت هاي بسيار پايين به انجام مي رسانند. براي مثال، تعدادي از هورمونهاي موجود در مهره داران از جنس پپتيدهاي كوچك مي باشند. از جمله اين هورمون هاي عبارتند از اكسي توسين ( با 9 ريشه اسيد آمينه ) كه توسط هيپوفيز خلفي ترشح شده و انقباضات رحمي را تحريك مي كند، برادي كينين ( 9 ريشه اي ) كه مانع التهاب بافت مي گردد و فاكتور آزاد كننده تيروتروپين ( 3 ريشه اي ) كه در هيپوتالاموس ساخته شده و رهاسازي هورمونهاي ديگري بنام تيروتروپين از غده هيپوفيز قدامي را تحريك مي كند. تعدادي از سموم قارچي، نظير آمانيتين و همچنين بسياري از آنتي بيوتيكها نيز جزء پپتيدهاي كوچك مي باشند.

مولكولهاي داراي اندازه قدري بزرگتر، شامل اليگوپپتيدها و پلي پپتيدهاي كوچكي نظير هورمون انسولين پانكراس مي باشند كه از دو زنجير پلي پپتيدي، يكي با 30 و ديگري با 21 ريشه اسيد آمينه، تشكيل شده است. هورمون ديگر پانكراس، يعني گلوكاگون، 29 ريشه دارد و با فعاليت انسولين مخالفت مي كند.

تنوع قابل توجهي در طول زنجيره هاي پلي پپتيدي موجود در پروتئين ها وجود دارد. سيتوكروم c انساني از 104 ريشه اسيد آمينه تشكيل شده است كه در يك زنجير به يكديگر متصل هستند. كيموتريپسين گاوي داراي 245 ريشه مي باشد. اكثر پلي پپتيدهاي موجود در طبيعت، كمتر از 2000 ريشه اسيد آمينه دارند.

تعدادي از پروتئين ها از يك زنجير پلي پپتيدي تشكيل شده اند، ولي بقيه آنها، تحت عنوان پروتئين هاي چند زير واحدي، متشكل از دو يا چند پلي پپتيد هستند كه بطور غير كووالان به يكديگر متصل مي باشند. زنجيره پلي پپتيدي موجود در يك پروتئين چند زير واحدي ممكن است يكسان و يا متفاوت باشند. درصورتيكه حداقل دو زنجير مشابه باشد، پروتئين را اوليگومر گويند و واحدهاي مشابه ( متشكل از يك يا چند زنجير پلي پپتيدي ) را پروتومر مي نامند. براي مثال هموگلوبين از چهار زنجير، شامل دو زنجير مشابه α و دو زنجير مشابه β، تشكيل شده است كه توسط تعامل هاي غير كووالان در كنار يكديگر قرار دارند.

تعدادي از پروتئين ها داراي دو يا چند زنجيره پلي پپتيدي هستند كه توسط پيوندهاي كووالان به يكديگر متصل مي باشند. براي مثال، دو زنجيره پلي پپتيدي انسولين توسط پيوندهاي دي سولفيدي به يكديگر متصل هستند.

با تقسم وزن مولكولي بر 110 مي توان تعداد حدودي ريشه هاي اسيد آمينه موجود در يك پروتئين ساده فاقد گروه شيميايي ديگر را محاسبه نمود. هر چند متوسط وزن مولكولي 20 اسيد آمينه معمول در حدود 138 مي باشد، اسيدهاي آمينه كوچكتر در پروتئين ها فراوانتر هستند؛ در صورتيكه نسبت وجود اسيدهاي آمينه مختلف را در پروتئين ها در نظر بگيريم آنگاه وزن مولكولي متوسط به 128 نزديك مي گردد. از آنجايي كه براي ايجاد هر پيوند پپتيدي، يك مولكول آب ( وزن مولكولي برابر 18 ) برداشت مي شود، وزن مولكولي متوسط يك ريشه اسيد آمينه موجود در پروتئين ها برابر 110 خواهد بود.

پلي پپتيدها داراي تركيبات اسيد آمينه اي مشخصي هستند

در اثر هيدروليز اسيدي پپتيدها يا پروتئين ها، مخلوطي از α- آمينو اسيدهاي آزاد بدست مي آيد. با هيدروليز كامل هر نوع پروتئين نسبت يا مخلوط مشخصي از اسيدهاي آمينه مختلف را ايجاد مي نمايد. بيست اسيد آمينه معمول تقريباً هرگز به مقادير برابر در پروتئين ها وجود ندارند. تعدادي از اسيدهاي آمينه ممكن است تنها يكبار در ساختمان يك پروتئين خاص وجود داشته باشند و يا اصلاً در آن مشاهده نگردند؛ در حاليكه بقيه ممكن است به تعداد زياد ديده شوند.

جدول زير تركيب مخلوط هاي اسيد آمينه اي حاصل از هيدروليز كامل سيتوكروم c و كيموتريپسينوژن ( پيش ساز غير فعال آنزيم گوارشي كيموتريپسين )‌گاوي را نشان مي دهد. اين دو پروتئين كه اعمال بسيار متفاوتي انجام مي دهند، از نظر تعداد نسبي هر كدام از اسيدهاي آمينه موجود نيز تفاوت قابل توجهي دارند.

هيدروليز كامل به تنهايي براي آناليز دقيق تركيب اسيد آمينه اي كافي نيست. زيرا در طي آزمايش امكان انجام واكنشهاي جانبي وجود دارد. براي مثال، پيوندهاي آميدي موجود در زنجير جانبي آسپاراژين و گلوتامين در حضور اسيد شكسته شده و در نتيجه آن به ترتيب موجب توليد آسپارتات و گلوتامات مي گردد. در اثر هيدروليز اسيدي، زنجير جانبي تريپتوفان تقريباً بطور كامل تخريب مي گردد و مقادير كمي از سرين، ترئونين و تيروزين نيز از دست مي روند.

توالي پروتئين ها :‌تعيين ساختمان اوليه

تا زمانيكه درجه همگوني يك پپتيد كه به كمك روش SDS-PAGE تعيين مي شود به بيش از 95 درصد نرسد، اطلاعات مربوط به توالي پپتيدها قابل تفسير نخواهد بود. بنابراين لازم است ابتدا پپتيدها را به كمك تكنيكهاي مرسوم براي تخليص پروتئينها بصورت خالص تهيه كرد. از روش SDS-PAGE بطور گسترده براي تعيين وزن مولكولي پپتيدها با مقايسه قابليت تحرك آنها با پپتيدهاي استاندارد كه وزن مولكولي آنها مشخص شده است، استفاده مي شود.

معمولاً قبل از تعيين توالي اسيدهاي آمينه موجود در يك پپتيد تركيب اسيدهاي آمينه آن را تعيين مي كنند تا اشتباهات احتمالي مشخص شده و اطلاعات بعدي در مورد توالي اسيدهاي آمينه تاييد گردد. ابتدا پيوند پپتيدي متصل كننده اسيدهاي آمينه با روش هيدروليز شكسته مي شود، سپس اسيدهاي آمينه آزاد شده با روش HPLC يا كروماتوگرافي مبادله يوني جدا و مشخص مي شوند.

در هيچ فرآيندي هيدروليز پپتيدها بطور كامل و بدون از دست رفتن برخي تركيبات اعظم انجام نمي گيرد. روش انتخابي براي هيدروليز پپتيدها با استفاده از نمونه هاي تكثير شده در HCl 6 نرمال است كه در دماي 110 درجه سانتيگراد و در لوله هاي شيشه اي داراي خلاء و كاملا در  بسته به مدت 24، 48، 72، 96 ساعت قرار مي گيرند. اين فرايند تمام مولكول هاي تريپتوفان ( Trp ) و سيستئين ( Cys ) را تخريب كرده و در صورت وجود يونهاي فلزي برخي از مولكولهاي متيونين ( Met ) و تيروزين ( Tyr ) نيز از بين مي روند. اسيدهاي آمينه سرين ( Ser ) و ترئونين ( Thr ) نيز بطور كامل بدست نمي آيند. پيوندهاي بين دو مولكول والين ( Val-Val ) ، دو مولكول ايزولوسين ( Ile-Ile‌ ) و بين والين و ايزولوسين ( Val-Ile و Ile-Val ) در برابر هيدروليز بسيار مقاوم بوده، اما گلوتامين ( Gln ) و آسپاراژين ( Asn ) گروههاي آميد خود را از دست داده، به اسيد گلوتاميك ( Glu ) و اسيد آسپارتيك ( Asp‌ ) تبديل مي شوند.

سيستئين قبل از هيدروليز به اسيد سيستئيك كه يك تركيب مقاوم در برابر اسيد است تبديل مي شود. ميزان تريپتوفان به دنبال هيدروليز بازي تخمين زده مي شود. در اين فرايند اسيدهاي آمينه سرين، ترئونين، آرژنين، وسيستئين از بين مي روند. اطلاعات مربوط به سرين و ترئونين از زمان صفر هيدروليز استنتاج مي شود و ميزان والين و لوسين از اطلاعات ساعت 96 تخمين زده مي شود.

Sanger اولين كسي بود كه توالي يك پلي پپتيد را مشخص كرد. Sanger در روش خود ابتدا دو زنجيره پلي پپتيدي A و B انسولين را از هم جدا كرده و سپس آنها را به كمك روشهاي آنزيمي خاص به پپتيدهاي كوچكتري تقسيم كرد كه در اين پپتيدها برخي توالي هاي مشابه وجود داشت. وي سپس با استفاده از 1- فلوئور و 2 و 4- دي نيتروبنزن هر بار يك ريشه اسيد آمينه از انتهاي N اين پپتيدها را جدا و مشخص نمود. وي توانست با مقايسه تواليهاي مشابه پپتيدها ساختمان اوليه هر دو زنجير A و B را بطور قطعي مشخص كند.

بعدها دو تكنيك تازه تر باعث ايجاد تحولي در روش تعيين ساختمان اوليه پلي پپتيدها ( پروتئين ها ) شد. تكنيك نخست كه توسط Edman در سال 1967 ارائه شد روند برداشت متوالي اتوماتيك و تشخيص ريشه هاي اسيد آمينه انتهاي N بصورت مشتقات فنيل تيوهيدانتوئين آنها بود. تكنيك دوم معرفي شيوه تعيين توالي سريع DNA بود كه بطور مستقل از يكديگر توسط Sanger و توسط Maxam و Gilbert ارائه شد. در حال حاضر بهترين كار آن است كه از هر دو روش همراه با هم استفاده شود.

پيش از تعيين توالي اسيدهاي آمينه بايد پلي پپتيدهاي بزرگ را خرد كرد :

وسايل تعيين توالي اتوماتيك اسيدهاي آمينه ( Sequenator ) در مورد پلي پپتيدهايي كه بطول 20 تا 60 ريشه اسيد آمينه هستند، بهترين كارايي را دارند. بنابراين بهتر است خرد كردن مولكول پلي پپتيدهاي بزرگ بصورت اختصاصي و كامل و در جايگاههاي نسبتاً نادر انجام گيرد. تركيبات زير داراي اين خصوصيت هستند :

1.      CNBr : ابتدا ريشه هاي سيستئين با استفاده از اسيد يدواستيك تغيير داده مي شود، سپس مولكول CNBr عمل خرد كردن پپتيدها را از سمت CooH متيونين انجام مي دهد. چون متيونين بطور نسبتاً نادر در پلي پپتيدها يافته مي شود.

2.      تريپسين : اين آنزيم روي ناحيه CooH ليزين و آرژنين عمل مي كند. چنانچه ابتداي ريشه هاي ليزين با استفاده از انيدريد سيتراكونيك به مشتق خود تبديل شود، تريپسين تنها بر ريشه هاي آرژنين اثر خواهد كرد. تعداد ريشه هاي ليزين در پپتيدها نسبتاً بيشتر است. البته روش فوق براي خرد كردن قطعات بعدي به كمك CNBr مفيد است.

3.      ارتويدوزوبنزن : ريشه هاي نسبتاً نادر Trp-X را جدا مي كند. در اين روش نيازي به حفظ كردن ريشه هاي ديگر نيست.

4.      هيدروكسيلامين : اين ماده پيوندهاي نسبتاً نادر بين آسپاراژين و گليسين را قطع مي كند. با اين حال اين روش فايده كمي چنداني ندارد.

5.      پروتئاز V8 : از استافيلوكوك طلايي بدست مي آيد. ريشه هاي پپتيدي بين اسيد گلوتاميك و ريشه X را قطع مي كند. پيوند اسيد گلوتاميك- ليزين در مقابل عمل اين پروتئاز مقاوم است. انجام اين واكنش قبل از خرد كردن قطعات در مرحله بعدي توسط CNBr مفيد است.

6.      هيدروليز اسيدي ملايم : در اين روش پپتيد نادر بين اسيد آسپارتيك و پرولين شكسته مي شود.

مخلوط پپتيدها را قبل از تعيين توالي آنها بايد جدا كرد

براي تخليص قطعات بدست آمده عمدتاً از روشهاي زير استفاده مي شود :

1.      صافي روي ژل در محلول اسيد استيك يا اسيد فرميك.

2.      كروماتوگرافي روي مايع با فاز معكوس.

3.      كروماتوگرافي مبادله يوني روي فسفوسلولز يا سولفوفنيل ( Sephadex ) در محلول اسيد فسفريك

كروماتوگرافي مبادله يوني و الكتروفورز با ولتاژ بالا ( HVE‌)، مولكول ها را بر اساس بار الكتريكي جدا كرده و در مورد جداسازي پلي پپتيدها با وزن مولكولي پايين و نيز اسيدهاي آمينه قابل استفاده اند. مقدار pK براي گروه كربوكسيل انتهاي C در يك پلي پپتيد بيشتر از گروه آلفا كربوكسيل در اسيد آمينه مربوطه است. برعكس گروه آمين انتهاي N نسبت به اسيد آمينه مربوطه اسيد قويتر است.

فيلتراسيون روي ژل : در روش تعيين توالي اتوماتيك تعداد كمي از پپتيدهاي بزرگ ( 30 تا 100 ريشه ) مورد استفاده قرار مي گيرد. ولي با اين حال، ممكن است بسياري از پلي پپتيدها با وزن مولكولي بالا كه تخريب شده اند، نامحلول شوند زيرا طي فرايند تجزيه، ريشه هاي هيدروفوب كه درون ساختمان پلي پپتيد قرار داشته اند آشكار مي شوند. براي حل اين مشكل  مي توان از اوره، الكلها، اسيدهاي ارگانيك يا بازها استفاده كرد.

HPLC يا فاز معكوس : يك تكنيك موثر براي تخليص پپتيدهاي غير قطبي با وزن مولكولي بالا، كروماتوگرافي مايع با عملكرد بالا روي ماده غيرقطبي همراه با شستشو توسط حلال هاي قطبي است. براي تخليص مخلوطهاي مركب پپتيدي كه از هضم ناكامل پروتئين ها بدست مي آيند مي آيند مي توان از هر دو روش صافي روي ژل و HPLC فاز معكوس همراه با هم استفاده كرد.

HVE روي غربالهاي مولكولي : براي تسهيل جداسازي مولكولها مي توان از غربال مولكولي همراه با جداسازي بر اساس بار الكتريكي استفاده كرد. بيشترين ماده اي كه در اين زمينه بكار مي رود پليمري از آكريلاميد با پيوندهاي متقاطع است.

پپتيدهاي مهم طبيعي

1.       گلوتاتيون : تري پپتيد بسيار مهمي است كه در بافتهاي گياهي و جانوري به وفور وجود داشته و از ريشه هاي اسيد گلوتاميك، سيستئين و گليسين تشكيل شده است. گلوتاتيون در واكنش هاي اكسيداسيون- احياء شركت مي كند.

2.       كارنوزين و آنسرين : دي پپتيد β- آلانين و هيستيدين بوده و در عضلات پرندگان ديده مي شوند. آنسرين يك گروه متيل بيشتر از كارنوزين دارد و گاهي متيل كارنوزين هم ناميده مي شود.

3.       اكسي توسين و وازوپرسين : اين دو اوليگوپپتيد، 9 ريشه اي بوده و به عنوان هورمون عمل مي كنند. اكسي توسين از غده هيپوفيز قدامي ترشح شده و بر عضلات صاف و انقباضات رحمي اثر محرك دارد. وازوپرسين نيز از هيپوفيز ترشح شده و باعث افزايش فشار خون مي گردد.

4.       برادي كينين : يك پپتيد 9 ريشه اي ( نانوپپتيد ) است كه باعث كاهش فشار خون مي گردد. ساختمان آن به قرار زير است .                   Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg

5.       كورتيكوتروپين : يك هورمون موثر بر غدد فوق كليوي است كه از هيپوفيز قدامي ترشح مي گردد. كورتيكوتروپين داراي 39 ريشه است و باعث تحريك رشد و فعاليت متابوليكي كورتكس غدد فوق كليوي مي گردد.

6.       انسولين : انسولين پلي پپتيدي با 51 ريشه است كه از غده پانكراس ( لوزالمعده ) ترشح مي شود. سكانس يا توالي اسيدهاي آمينه موجود در ساختمان انسولين توسط « سانجر » در سال 1953 تعيين گرديد. انسولين باعث كاهش قند خون مي گردد.